龟纹瓢虫生长发育及卵巢与滤泡上皮细胞的研究

皇甫宁博，高雪珂，王丽，朱香镇，张开心，李东阳，姬继超，雒珺瑜，崔金杰

（中国农业科学院棉花研究所/ 棉花生物学国家重点实验室，河南安阳 455000）

我国是农业大国，农田作物经常遭受多种病虫的危害，常年因病虫造成的作物损失达25%～30%， 重灾年份某些作物损失可在50%以上，甚至绝收[1]。 此外，我国农业种植结构和耕作制度不断变更，加上异常气候愈发频繁，使得农作物病虫防控工作面临新的挑战[2]。而目前，化学防治仍然是我国农田的主要害虫防治方法[3]。 该防治方法可有效快速地达到防治目的，对农作物的丰产丰收起到重要的保障作用。 但是，随着化学农药的高频次、高剂量使用，其对生态环境的严重污染和农药使用者的身心健康的威胁已成为世界各国研究学者关注的焦点和热点[4]。 生物防治是指利用一种生物对另外一种生物进行预防和调控的防治方法，可在很大程度上避免使用化学农药带来的生态环境污染，减少施用农药引起的中毒事件的发生，因此越来越受到人们的重视[5]。

龟纹瓢虫（Propylea japonica）属鞘翅目、瓢甲科，在我国分布广泛，对环境条件的适应性广，是我国农田害虫的一种种群数量较大的优势捕食性天敌[6-7]，其幼虫和成虫均可大量捕食农田害虫，成虫一昼夜在棉田最多可捕食棉蚜226 头[8]、棉铃虫卵21 粒[9]。 因此，若能大规模人工饲养龟纹瓢虫并适时释放到田间，将对农田害虫的防治具有重要意义。 然而，在人工饲养时，只有饲喂活体害虫的龟纹瓢虫才能进行正常繁殖[10]；而人工饲料饲喂繁殖尚未完全成功，主要问题是人工饲料饲养的龟纹瓢虫成虫产卵前期长，产卵量少[11]。可见，为解决当前人工扩繁难题，明确龟纹瓢虫的生长发育、生殖发育相关参数以及卵发生和滤泡上皮细胞发育规律至关重要。

因此，本研究通过室内饲养试验确定龟纹瓢虫各虫态发育历期、体长、体宽及产卵量，通过显微观察和细胞骨架染色的方法，明确龟纹瓢虫的卵巢滤泡上皮细胞的动态变化规律，以期为进一步研究龟纹瓢虫生殖发育调控机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

龟纹瓢虫种群在中国农业科学院棉花研究所温室养虫室连续纯化多代， 并置于纱网笼（25 cm×25 cm×25 cm）中进行饲养，每笼放4 盆接有豌豆修尾蚜（Meguora crassicaudoMordvilko）的蚕豆苗，并根据其生长状况定期更换带豌豆修尾蚜的新鲜植株。 龟纹瓢虫的实验室饲养条件：光照时间/黑暗时间为14 h/10 h，温度（25±1）℃，相对湿度60%±5%。 豌豆修尾蚜的实验室饲养条件： 光照时间/ 黑暗时间为14 h/10 h， 温度（20±1）℃，相对湿度60%±5%。

1.2 试验所用工具及试剂

1.2.1试验工具。 解剖镊、解剖针、载玻片、蔡司显微镜彩色相机（Zeiss Axiocam 305 color camera，德国）、体视解剖显微镜（Zeiss SteREO Discovery V8 stereomicroscope， 德国）、 荧光体视显微镜（Axlo ZooM.V16，德国）。

1.2.2试 剂。 Alexa Flour488 Phalloidin（Invitrogen，美国）、Hoechst 33342（Sigmae-Aldrich，美国）、5%（质量分数）BSA 封闭液、Triton X-100（购自北京索莱宝科技有限公司）、4%（质量分数）多聚甲醛（购自上海源叶生物科技有限公司）、抗荧光淬灭封片液（购自碧云天生物技术有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1龟纹瓢虫生长发育观察。 收集相同时期孵化的龟纹瓢虫幼虫，放入培养皿中，每天放入足量豌豆修尾蚜进行饲喂，利用Zeiss Axiocam 305 color camera 和Zeiss SteREO Discovery V8 stereomicroscope， 对龟纹瓢虫1 龄、2 龄、3 龄和4 龄幼虫、蛹、雌成虫进行拍照，测量体长和体宽，每天定时观察记录龟纹瓢虫蜕皮和发育情况。 将羽化后成虫采用7 mL 离心管配对，并单对饲养，记录单头雌成虫每天产卵量，直到试虫死亡。 每个虫态均设15 个重复，每个重复用1 头试虫。

1.3.2龟纹瓢虫卵巢解剖和滤泡上皮细胞动态变化。收集成对饲养的龟纹瓢虫雌成虫，在1×磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline，PBS）中活体解剖，先用镊子去除足和鞘翅，然后分离胸部和腹部，保留完整的腹部，再用镊子从腹部侧面慢慢撕开位于腹部背面的表皮组织， 露出整个卵巢，除去肠道和卵巢周边脂肪组织，用PBS 缓冲液冲洗3 次。

羽化后1～5 d，记录每个卵巢管发育成熟卵数以及卵泡个数。分别选取羽化后1 d、3 d、5 d 的成虫，从其卵巢中剥离单独卵巢小管，除去卵巢小管外面包裹的膜鞘，用4%（质量分数）多聚甲醛于室温固定20 min，之后用1×PBS 进行冲洗，去除多聚甲醛残留。 将固定并洗涤好的卵巢小管放于0.3%（体积分数）PBST（1×PBS 中加入0.3%Triton X-100）中，室温下穿膜20 min，洗涤去除PBST 残留， 加入Alexa Flour488 Phalloidin 浓度为0.165 μmol·L－1的PBS-BSA 缓冲液， 于室温下避光温育30 min 后进行细胞骨架染色，再次洗涤后加入含5 μmol·L－1Hoechst 33342 的PBS缓冲液中，于室温、避光条件下温育30 min，之后再次洗涤去除染料残留，放在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片液，利用AXLO ZooM.V16 荧光显微镜进行拍照观察。 每个处理均设置9 个生物学重复，每个重复用1 头雌虫。

1.4 统计分析

分别采用SPSS 22.0 和Graphpad Prism 6 进行数据分析和作图， 采用Photoshop 和Adobe Illustrator 2020 软件进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 龟纹瓢虫的生长发育与产卵量

2.1.1龟纹瓢虫不同虫态体长与体宽。1～4 龄龟纹瓢虫幼虫中，2 龄到3 龄的体长增加最快，平均每天增长3.76 mm±1.03 mm，4 龄时达到最长体长9.32 mm±0.27 mm（图1A）。 体宽的增长趋势和体长基本一致，均随着龟纹瓢虫龄期的增加而增加， 其中幼虫在4 龄期体宽为2.91 mm±0.14 mm，蛹期体宽为3.27 mm±0.08 mm，雌成虫体宽为3.70 mm±0.05 mm， 蛹期总体上较幼虫期更宽（图1B）。

2.1.2龟纹瓢虫发育历期和产卵量。 龟纹瓢虫1龄、2 龄、3 龄、4 龄幼虫平均历期分别为1.13 d±0.09 d、1.48 d±0.11 d、1.34 d±0.08 d 和2.34 d±0.06 d，蛹期平均历期为2.81 d±0.08 d，雌成虫平均历期为51.08 d±1.13 d， 雄成虫平均历期为48.36 d±1.29 d， 雌性和雄性成虫平均历期无显著差异（图2A）。产卵前期为5.09 d±0.79 d，约在第10 天达到产卵高峰期， 单雌日均产卵量最高为14.42 粒±2.36 粒（图2B），在第20 天之后产卵量逐渐下降。 平均单雌累计产卵量为414 粒±41.27 粒，最高可达654 粒。

2.2 龟纹瓢虫卵巢形态特征与发育级别划分

2.2.1雌性生殖系统和卵巢管形态与结构。 龟纹瓢虫雌性生殖系统包括1 对卵巢、1 对侧输卵管、1 条中输卵管、1 个受精囊、1 个生殖腔（图3A）。龟纹瓢虫卵巢为端滋式卵巢， 每侧卵巢包括9～12 个卵巢小管，卵巢小管被端部端丝包被缠绕束缚一起（图3A）。 成熟的卵巢管由端丝、原卵区和生长区3 个部分组成（图3A～B）。卵巢管内不同位置有不同发育阶段的卵细胞（图3C）。

2.2.2龟纹瓢虫卵巢发育分级。 对羽化后1～5 d龟纹瓢虫雌虫卵巢进行解剖，统计成虫羽化后卵巢管日平均成熟卵数以及处于不同发育阶段的卵泡数、卵巢管宽度，并根据这些参数把龟纹瓢虫卵巢发育分为4 个级别（图4）。Ⅰ级：成虫羽化后1～2 d，开始能观察到卵泡，没有卵发育成熟，卵巢管宽度增加缓慢， 由第1 天的153.04 μm±5.77 μm 增加至第2 天的191.47 μm±7.56 μm；Ⅱ级：羽化后2～3 d，单个卵巢管至多出现2 个不同发育时期的卵泡，没有卵发育成熟，卵巢管宽度开始快速增加， 由第2 天的191.47 μm±7.56 μm 增加至243.42 μm±16.70 μm； Ⅲ级：羽化后3～4 d， 卵巢管出现2～3 个不同发育时期的卵泡，平均每个卵巢管有0.12 粒±0.01 粒卵发育成熟， 卵巢管宽度快速增加至417.51 μm±24.09 μm；Ⅳ级：羽化后4～5 d，大多卵巢管包含3 个处于不同发育时期的卵泡， 每个卵巢管平均有0.37 粒±0.02 粒卵发育成熟，个别个体已有部分卵粒排出，在中输卵管有待产卵粒，卵巢管宽度增加至565.10 μm±15.12 μm，并保持稳定。

2.3 龟纹瓢虫滤泡上皮细胞及其发育

2.3.1滤泡上皮细胞形态学观察。 采取细胞核、细胞骨架染色法探究了龟纹瓢虫羽化后第1、3、5天滤泡上皮细胞的动态变化规律。 在雌成虫羽化后第1 天，滤泡上皮细胞为圆形，细胞之间紧密排列，细胞核充满整个细胞，滤泡上皮细胞之间没有间隙出现 （图5A～C）。 雌成虫羽化后第3天，细胞体积变大但仍紧密排列，细胞核依然占据大部分细胞空间， 细胞形状由圆形变成多边形，还未出现卵黄沉积，没有观察到孔隙出现（图5D～F）。 在成虫羽化后第5 天，细胞体积进一步变大， 由规则的多边形变成不规则的多边形，细胞排列疏松，细胞间隙变大，能够明显观察到滤泡上皮细胞之间间隙的出现（图5G～I）。

2.3.2滤泡上皮细胞细胞核和细胞核间距。 羽化后第1 天至第3 天， 雌成虫滤泡上皮细胞核间距由1.94μm±0.13μm 变为4.57μm±0.36μm， 细胞核直径由8.50 μm±0.32 μm 增加到11.06 μm±0.39 μm，细胞排列紧密，细胞核几乎充满整个细胞（图5A～F），表明该时期细胞逐渐增大，但间隙尚未形成。在雌成虫羽化后第3～5 天发育过程中，滤泡上皮细胞核间距急剧变大，由第3 天的4.57 μm±0.36 μm 增 大 到16.4 μm±1.05 μm（图6A），细胞核直径也由第3 天的11.06 μm±0.39 μm 增加到第5 天的15.76 μm±0.36 μm （图6B），细胞排列疏松。

3 讨论

体型大小是衡量昆虫繁殖能力、 捕食能力、活动能力和环境适应能力重要指标之一[12-14]。 本研究对龟纹瓢虫各发育阶段体长体宽进行测定，龟纹瓢虫1～4 龄幼虫， 其中2 龄到3 龄的体长增加最快， 体宽的增长趋势和体长基本一致，在末龄幼虫期，体长增加减慢，体宽仍快速增加，积累大量营养物质准备化蛹；成虫体长为5.35 mm±0.07 mm，体宽为3.70 mm±0.05 mm。 总体来说，龟纹瓢虫成虫期体长小于植食性瓢虫平均值（7.2 mm），大于捕食性瓢虫平均值（4.48 mm）[15]。刘德波[16]对瓢虫体长、体宽的研究发现，处在不同海拔、植被和季节的同种瓢虫的体长和体宽存在明显差异。 这说明在相应生理指标的比较研究中需要考虑环境因素。毕孟杰等[15]研究发现，瓢虫的体长、体宽主要受到温度影响，并且符合贝格曼法则，即体型随着温度增加而变大。 耐饥力假说或许对这些现象能够做出解释，即体型越大的昆虫储存能量越多，越适合在猎物可获得性减少的环境中生存[17]。

本研究中，对龟纹瓢虫不同虫态发育历期测定结果显示，龟纹瓢虫幼虫历期为6.28 d±0.16 d，蛹期平均为2.81 d±0.08 d， 雌成虫平均历期为51.08 d±1.13 d， 雄成虫平均历期为48.36 d±1.29 d。 这些结果与陈洁等[18]、程树兰等[19]和杨建华[20]报道的基本一致。 龟纹瓢虫发育历期小于陈洁等[21]和周雷等[22]报道的异色瓢虫和茄二十八星瓢虫发育历期，然而捕食性瓢虫龟纹瓢虫的最适生长温度（25 ℃）与异色瓢虫相同，而与植食性瓢虫茄二十八星（31 ℃）存在较大差别。 因此，在农业生产中，应考虑创造有利于天敌而不利于害虫的生存环境， 从而达到抑制害虫种群增长的目的。 龟纹瓢虫成虫在羽化后第5 天开始产卵，约在第10 天达到产卵高峰，一生平均产卵量为414粒，最高产卵量达到654 粒。这与陈洁等[18]和潘悦等[23]报道的每只雌成虫平均产卵量749 粒和600粒稍有不同，推测可能与饲喂材料不同或者虫源地域不同有关。

龟纹瓢虫雌成虫羽化后第2 天在卵巢管卵原区内能观察卵泡，在第3 天单个卵巢管最多出现2 个不同发育时期的卵泡， 在第4～5 天卵泡数最多为3 个。大多数昆虫卵巢管有多个卵泡[24]，鳞翅目昆虫每个卵巢管含有超过100 个卵泡[25]。在羽化后第4 天，龟纹瓢虫卵巢管开始有成熟卵出现，到第5 天成熟卵比例增加并开始产卵。 这与张丽莉等[11]报道的龟纹瓢虫产卵时间基本一致。 不同于陈洁等[26]根据异色瓢虫中有无卵室以及卵黄沉积情况进行卵巢发育分级的方式，本研究倾向于依据具体的发育参数进行分级，根据不同发育阶段特定卵泡数、发育成熟卵数和不同发育程度卵巢管宽度把卵巢发育分为4 级。

通过对滤泡上皮细胞细胞核和细胞骨架染色，观察了不同发育阶段滤泡上皮细胞形态变化以及滤泡上皮细胞间隙开放动态，并对其变化原因进行了分析，为进一步探索滤泡上皮细胞间隙开放调控机制奠定了基础。 保幼激素被证明参与滤泡上皮细胞孔隙开放的调控，能够通过蛋白激酶-C 依赖的级联反应作用于滤泡细胞， 刺激膜结合的Na+/K+-ATPase 离子平衡发生改变， 导致水分流失、细胞收缩，进而调控滤泡细胞之间孔隙开放[27]。在一些鞘翅目昆虫中，通过保幼激素激活Na+/K+-ATPase 造成滤泡上皮细胞缩水这种调控滤泡细胞孔隙开放的机制也被证实[28]。 滤泡上皮细胞不仅调控卵黄摄取，而且在昆虫退化的卵室中参与清理周围死亡的生殖细胞，对有效去除死细胞维持体内平衡至关重要[29]。

本研究就龟纹瓢虫的生长发育、卵发生与滤泡上皮细胞发育动态做了初步研究，加深了对龟纹瓢虫生物学及生殖系统结构的认识，为龟纹瓢虫生殖相关研究提供了新的基础信息。 但本研究仅是基于实验室饲养条件下取食豌豆修尾蚜种群的龟纹瓢虫，没能对取食人工饲料的龟纹瓢虫卵泡、卵和滤泡上皮细胞发育进行相关探究。 今后应进行相关研究，并更深层次探索相关生殖调控机制。

4 结论

以我国棉田瓢虫优势种龟纹瓢虫为试虫，明确其在实验室中以豌豆修尾蚜为食条件下的相关生长发育和生殖发育参数，明确了龟纹瓢虫雌性生殖系统结构，系统观察了卵泡、卵和滤泡上皮细胞的发育过程。 根据不同发育阶段特定卵泡数、发育成熟卵数和不同发育程度卵巢管宽度将其卵巢发育分为4 级；明确了其成虫羽化后1 d、3 d、5 d 滤泡上皮细胞的形态变化，并在卵黄沉积期观察到滤泡上皮细胞之间形成的间隙用于卵母细胞摄取卵黄原蛋白。