基于隶属函数法对不同基因型棉种萌发期抗氧化能力的综合评价

王洪博，付媛媛，杨鸿基，孙文君，高阳，王兴鹏*

（1.塔里木大学水利与建筑工程学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学植物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；3.中国农业科学院农田灌溉研究所，河南 新乡 453000）

关键字：棉种萌发；环境胁迫；隶属函数；聚类分析；抗氧化酶

2017年，中国农业科学院棉花研究所成功培育出适于新疆地区无膜直播的特早熟棉花新品种——中棉619。新品种的成功选育和无膜栽培技术取得的突破性进展，为解决棉田残膜污染提供了可行的技术途径[1]。在南疆地区，植物生长发育常受盐渍、干旱、高低温、强光照等不利因素的影响[2-4]，其中干旱[5]、低温[6]和盐渍[4]是植物生长最主要的逆境生态因子，显著影响种子的萌发[7-8]。在环境胁迫或生物胁迫条件下，过量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在植物体内造成氧化胁迫[5]，而植物利用超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过 氧 化 物 酶（Peroxidase，POD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）等抗氧化酶促保护系统和非酶促保护系统清除植物体内多余的活性氧，降低膜脂过氧化水平，减轻细胞膜受害程度[9-11]。

干旱胁迫会破坏植物体内活性氧代谢平衡，引起膜脂过氧化[12]，对膜系统、细胞、器官甚至整株植物造成伤害[13]。抗旱性强的棉花品种的SOD活性随着干旱处理时间延长而增加[14]，过表达SOD能提高植物对干旱、盐渍等非生物胁迫的适应性[15]，即抗氧化酶活性的提高可增强植物的综合抗性[5]。盐胁迫诱使植物体内产生大量的活性氧自由基，导致活性氧代谢失衡，膜脂过氧化程度加重，膜结构和功能被破坏，蛋白质和叶绿素降解，从而降低植物光合性能[16]。然而，盐胁迫下植物体内合成累积的一些小分子有机物质，如氨基酸、可溶性糖等可以减轻盐胁迫对植物的伤害[17]。低温逆境会导致植物多方面损伤，包括生物膜透性增大[18]、活性氧积累引起的氧化胁迫[19-20]、渗透调节失衡、多种蛋白质变性，酶活性降低甚至丧失[21]。而植物在低温逆境中会通过调节抗氧化酶活性[22]和积累渗透调节物质[23]增强植物抗逆性。棉花由覆膜种植转为无膜种植，导致棉种萌发的外界环境发生改变。因此，本试验以南疆膜下滴灌主栽品种新陆中37（具有适应性好、抗性强的特点）为对照，研究了水、盐、温及其交互作用对无膜直播中棉619可溶性蛋白含量、淀粉酶及抗氧化保护酶活力的影响，评估其抗氧化能力，以期为抗旱、耐盐及耐寒棉花品种选育和种植栽培提供依据，从而促进棉花无膜栽培技术的大面积推广，进而解决地膜残留问题。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2019年在农业农村部作物需水与调控重点实验室进行。供试棉花品种为T1：中棉619（无膜滴灌主栽棉种）；T2：新陆中37（膜下滴灌主栽棉种）。选择PEG（因素A）、NaCl（因素B）及温度（因素C）3个主要环境因子，每个因子设置5个水平 （因素A1～A5：5.0%、7.5%、10.0%、12.5%和15.0%（质量分数，下同）；因素B1～B5：0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%；因素C1～C5：13℃、16℃、19℃、22℃和25℃），参考6因素5水平的L25（56）的正交表设计[24]，如表1所示。

表1 正交表Table 1 Orthogonal table

棉种消毒后在超纯水中浸泡24 h，取出后剥掉种皮[25]，各处理挑选大小一致、籽粒饱满的30粒种子播种于直径为9 cm的培养皿（经150℃高温灭菌2 h，底部铺有2层经酒精浸泡后风干的滤纸）[26]，加入5m L处理液，以超纯水为空白对照，置入不同温度的生化培养箱中培养，自萌发后第4天给予光照，昼/夜时间为12 h/12 h。

1.2 测定指标与方法

种子连续萌发8 d，其间每天记录发芽种子数，以胚根突破种皮长度达到种子长度的一半作为萌发标准[27]，于第8天分3份收取培养皿内所有胚芽，并利用南京生物建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶试剂盒（WST-1法）、过氧化物酶试剂盒（分光光度比色法）、过氧化氢酶试剂盒（钼酸铵法）、可溶性蛋白试剂盒（BCA微板法）及β-淀粉酶试剂盒（分光光度比色法），按照试剂盒说明书要求操作，分别测定可溶性蛋白含量和SOD、POD、CAT、及淀粉酶的活力。

1.3 相关指标的计算

（1）综合指标CIi参考程建权模糊数学建模[28]的方法计算：

式中：CI i表示第i个综合指标；Eij表示第i个主成分第j个单项指标对应的特征向量；Xj表示第j个单项指标的标准化值。

（2）隶属函数μij、综合指标权重wj及综合评价值D参照王贺正[29]的方法计算：

数据标准化：运用模糊数学隶属函数法对萌发指标进行标准化，如公式（2）和（3）：

权重处理：采用标准差系数法，计算标准差系数Vj，归一化后得到各个萌发指标的权重系数W j，如公式（4）：

综合评价值D：棉种抗旱、耐盐及生长综合评价值D的计算，如公式（5）：

式中：μij表示i种类j指标的隶属值；Xij表示i种类j指标的测定值；Xjmax、Xjmin分别表示指标的最大值和最小值；Vj表示标准差系数。

1.4 数据分析

采用M icrosoft Excel 2010进行数据处理，SPSS 26软件进行主成分程序运算及聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同环境因子下棉种萌发的生理指标直观分析

由试验指标和平均值计算判断试验因素的优水平和优组合，根据极差计算判断试验因素的主次顺序，本文以2种棉种可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及总淀粉酶活性力7个生理指标进行极差分析。由表2可知，不同水、盐、温胁迫组合下2个棉种生理指标在呈现不同程度的变化，如中棉619棉种POD和SOD的活力分别在PEG浓度为5%、NaCl浓度为0.1%及温度为25℃，PEG浓度为7.5%、NaCl浓度为0.6%及温度为25℃时最高；而新陆中37棉种POD和SOD分别在PEG浓度为5%、NaCl浓度为0.2%及温度为19℃，PEG浓度为5%、NaCl浓度为0.1%及温度为16℃时活力最高。

表2 （续）Table 2(Continued)

表2 棉种萌发生理指标的极差分析Table 2 Range analysis of physiological indexes of cotton seed germ ination

2.2 不同环境因子下棉种萌发生理指标主成分分析

数据标准化后进行主成分分析，用SPSS 26软件进行主成分程序运算，得到样本相关矩阵的特征向量和累计贡献率，如表3所示。对于中棉619棉种而言，前2个主成分的贡献率分别为74.4 7%和15.3 3%，表明PC1和PC2代表了原来7个单项指标89.8 0%的变化。而对于新陆中37棉种而言，前2个主成分的贡献率分别为75.2 2%和14.4 6%，表明PC1和PC2代表了原来7个单项指标89.6 7%的变化。两棉种可将原来的7个单项指标转换为2个新的相互独立的综合指标，在2个新确定的综合指标中，中棉619棉种第1主成分中SOD、α-淀粉酶、β-淀粉酶及总淀粉酶的特征值较大，分别为0.44 、0.43 、0.43 及0.43 ，第2主成分中CAT的特征值最大，为0.86 。而新陆中37棉种第1主成分中SOD、β-淀粉酶及总淀粉酶的特征值较大，均为0.43 ，第2主成分中CAT的特征值最大，为0.99 。表明SOD和CAT指标的贡献率较大，影响程度较高，可作为棉种抗旱、耐盐、耐寒性筛选的依据。

表3 各主成分的特征向量及贡献率Table 3 The feature vector and contribution rate of each principal com ponent

2.3 不同环境因子下棉种萌发生理指标综合评价

棉种萌芽期各处理的综合指标、隶属函数值、权重、综合评价值和排序，如表4所示。中棉619棉种综合评价值的变化范围0.06 ～0.91 ，在PEG浓度为15%、NaCl浓度为0.4%及温度为13℃时综合评价值达到最高，而新陆中37棉种综合评价值的变化范围0.07 ～0.85 ，在PEG浓度为5%、NaCl浓度为0.4%及温度为19℃时综合评价值达到最高。表明在此环境下，可溶性蛋白含量较高，POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及总淀粉酶活性达到最大值。

表4 萌芽期各处理的综合指标、隶属函数值、权重、综合评价值和排序Table 4 Com prehensive index,subordinate function value,weight,com prehensive evaluation value and ranking of each treatment in the germ ination stage

2.4 不同环境因子下棉种萌发生理指标聚类分析

采用标准化转换后的综合评价值、欧氏距离及类平均法对各处理的生理指标进行聚类分析，结果见图1。以综合评价值最高为依据，在距离为12时可将25种组合处理分为三大类。第一类（C1）可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及总淀粉酶活性较高，中棉619包含4种组合，而新陆中37包含15种组合；第二类（C2）各组合抗氧化酶活性中等，中棉619包含14种组合，而新陆中37包含9种组合；第三类（C3）各组合抗氧化酶活性较低。较高的可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及总淀粉酶活性，反映出棉种受逆境胁迫的程度较大。

图1 棉种生理指标的聚类分析Fig.1 Cluster analysis of cotton seed physiological indicators

3 讨论

当植物受到外界环境胁迫时，可溶性蛋白含量及抗氧化保护酶活力等生理代谢指标发生变化，常被用于评价作物的抗逆性[30]。本研究对2个棉种的可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及总淀粉酶活力7个生理指标进行极差分析，发现2个棉种的上述生理指标在不同水、盐、温胁迫组合下呈现不同程度的变化，说明种质资源间的抗性存在较大的差异[31]。同时，不同类型的胁迫下，棉种的生理生化指标的表现也存在差异[32]，这是因为起主导作用的抗氧化酶活力有差异[33]。因此，要确切鉴定一个品种的抗性强弱，不能根据某个单一生理生化指标或形态表现进行判定[34]，而应根据多个指标进行综合分析。

主成分分析是数据降维的一种方法，既减少了变量的个数，又能体现变量间的内在联系。本研究对外界环境胁迫下2个棉种的7个单项指标进行主成分分析，前两个主成分累计贡献率分别为89.8 0%（中棉619）和89.6 7%（新陆中37），其中主成分1分别解释了中棉619 74.4 7%和新陆中37 75.2 2%的变化。通过主成分分析，发现SOD和CAT可以作为2个棉种抗旱、耐盐、耐寒性的筛选指标，这与胡根海等[33]的研究结果类似。有研究发现酶促保护系统中SOD是植物体内ROS的清除剂，是ROS防御的第一道防线[35]，可催化O2－生成H2O2的歧化反应[36]；CAT则直接催化H2O2生成H2O和O2，减少体内过量ROS，降低膜脂过氧化水平[13]。

隶属函数法通过无量纲化将各指标都转换为0～1的数值，从而将不同指标放到了同一量级上，增强不同指标间的可比性，可以较好地定量评价每个处理[37]。本研究通过隶属函数法计算棉种萌发生理指标的综合得分，进行隶属函数值比较，综合评价值越大，表明棉种萌发生理指标越强，对环境胁迫的抗性越高。对中棉619而言，PEG浓度为15%、NaCl浓度为0.4%及温度为13℃时综合评价值D达到最大，为0.91 。而新陆中37棉种在PEG浓度为5%、NaCl浓度为0.4%及温度为19℃时综合评价值D达到最大，为0.85 。中棉619在环境胁迫较严重时，生理指标才表现为较高的强度，说明新陆中37棉种的抗旱及耐寒性均低于中棉619，对环境的适应能力较差，这与孙小芳等[38]得出棉花萌发和生长的极限土壤含盐量约为0.4%～0.6%的结论相一致。棉种在较严重的环境胁迫下仍能完成萌发进程，这是因为受到环境胁迫时，通过提高体内抗氧化保护酶的活性，能有效地调节ROS代谢平衡，降低膜脂过氧化程度，保护膜结构的完整性，增强其在环境胁迫下的抗氧化能力[39]。

聚类分析作为一种无管理模式的识别方法，可将相同或相似的一类进行划分[40]。通过聚类分析将中棉619在25个处理下的抗氧化酶活性分成三类，其中处理1、8、19和23的可溶性蛋白含量、POD、SOD、CAT、α-淀粉酶、β-淀粉酶及总淀粉酶活性较高。而较高的抗氧化酶活性反映了植株受到严重的外界环境胁迫，因此，C1类别的水、盐、温组合条件对中棉619造成较严重的胁迫。此外，植物对不同胁迫因素存在交叉适应，例如，土壤盐分及温度可影响干旱胁迫对植物的伤害。土壤盐分一方面导致植物细胞内的离子积累[41]，有利于降低组织渗透势、增强吸水动力，积累离子参与渗透调节；另一方面还可减少干旱条件下有机渗透调节物质合成所需的物质和能量消耗，这对植物的水分代谢和同化物积累可能是有益的[5]。而在适宜的温度条件下，干旱胁迫对种子发芽的抑制强度低于亚适温和超适温条件，通过激活体内酶保护机制，累积渗透调节物质用以抵御水分胁迫，维持正常的生理代谢，缓解干旱对种子发芽的不利影响[42]。

4 结论

本文基于正交试验、主成分分析、隶属函数法及聚类分析，研究了水、盐、温及其交互作用等环境因子对无膜滴灌棉种及膜下滴灌棉种萌发时抗氧化系统的影响，得出SOD和CAT活性可以作为棉种抗旱、耐盐、耐寒性筛选的依据。无膜滴灌棉种中棉619在PEG浓度为15%、NaCl浓度为0.4%及温度为13℃时抗氧化酶活性达到最大，而新陆中37的抗氧化酶活性在PEG浓度为5%、NaCl浓度为0.4%及温度为19℃时达到最大，表明中棉619抗氧化酶活性优于膜下滴灌主栽棉种新陆中37，具有较高的抵抗环境胁迫的能力。