当归转录因子AsMYB44的克隆与功能研究

刘光瑞,宗 渊,李 云,曹 东,刘宝龙,包雪梅,3,李建民

(1.青海师范大学 生命科学学院,青海 西宁 810008; 2.中国科学院 西北高原生物研究所,青海省作物分子育种重点实验室,青海 西宁 810008; 3.中国科学院 藏药研究重点实验室,青海 西宁 810008)

当归[Angelicasinensis(Oliv.) Diels]是伞形科当归属多年生草本植物,主要以根部入药,是我国传统的大宗药材,药用历史悠久,广泛应用于各类方剂中[1-3]。当归根中富含挥发油、有机酸、多糖、氨基酸、黄酮类等活性成分,药理价值高,具有抗炎[4]、抗肿瘤[5-7]、抗氧化[8]、保肝护肝[9]、抗抑郁[10-11]、强肾健体[12],以及促进造血[13-14]、舒张平滑肌[15]等作用。与其他中药材相比,当归中有机酸多为酚酸类化合物[16],酚酸具有多种药理作用,如抗肿瘤、抗癌等[17-20]。

药用植物次生代谢产物的生物合成和积累受到多种转录因子的调控,如MYB、bHLH、WRKY、ERF、bZIP等[21]。转录因子与植物多种生理活动、生长发育调控、胁迫应答等过程密切相关,例如,通过调控结构基因的表达,进而调节次生代谢产物的合成和积累[22-28]。MYB转录因子家族根据保守结构域的特征可分为4大类,包括1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB,进一步分为28个亚家族[29]。其中,R2R3-MYB转录因子在黄酮、萜类等化合物的合成代谢中具有明显的调控作用[22],如苦荞[Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.]FtMYB23通过调控黄酮合成途径中结构基因的表达,促进原花青素的合成和积累[30];在低温胁迫下FtJAZ2可正向调控花青素的合成和积累[31]。西伯利亚白刺(NitrariasibiricaPall.)NsMYB1能调控果实花青素的合成和积累[32]。红花(CarthamustinctoriusL.)CtFRMYB1和CtFRMYB2能调控类黄酮的合成代谢[33]。尽管多种植物的MYB转录因子已被克隆和验证,但当归MYB转录因子鲜有报道。

基于课题组前期的研究,从当归不同时期转录组测序结果中筛选到1个差异表达的MYB转录因子AsMYB44,其在根中高表达。通过同源比对,初步推测AsMYB44与根部酚酸的特异积累相关,但AsMYB44的功能尚不明确。本研究拟克隆转录因子AsMYB44,通过生物信息学分析、农杆菌介导获得转基因植株、转录组学和广泛靶向代谢组学对其调控次生代谢物合成的功能进行研究,为进一步研究AsMYB44参与当归次生代谢产物合成的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

当归(Angelicasinensis)、Samsun烟草(Nicotianatabacum)种植于青海省作物分子育种重点实验室育种室。大肠埃希菌(Escherichiacoli)感受态细胞DH5α、农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感受态细胞EHA105购自北京博迈德基因技术有限公司。卡那霉素(kanamycin,Kan)、利福平(rifampicin,Rif)购自上海麦克林生化科技有限公司。DNAsecure Plant Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)、Tiangen TIANgel Midi Purification Kit试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa Code No.6210A)、SacⅠ限制性内切酶、XbaⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa(大连)公司。ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Q711-02)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。Nano drop 2000 (Thermo Fisher Scientific)、QuantStudioTM3 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)。

1.2 当归RNA提取与cDNA合成

新鲜当归经液氮冷冻后,用高速研磨机打碎成粉末,使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)提取总RNA,用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带质量。用Nano drop 2000 (Thermo Fisher Scientific)测定其浓度,用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA。

1.3 基因克隆与植物过表达载体的构建

根据本课题组前期筛选得到的AsMYB44基因序列,通过Primer Premier 5软件设计引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以当归cDNA为模板和表1中相应引物扩增AsMYB44基因。PCR反应程序：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,30个循环;72 ℃ 10 min。用Tiangen TIANgel Midi Purification Kit试剂盒回收PCR产物,然后用XbaⅠ和SacⅠ限制性内切酶双酶切,用T4 DNA连接酶4 ℃过夜连接,构建植物表达载体pCAMBIA2300s：AsMYB44。然后转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,菌落PCR鉴定后选取阳性单克隆,送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序无误后,挑取阳性克隆,提取质粒备用。

表1 引物序列

1.4 生物信息学分析

使用MEGA 11.0软件的Neighbour-joining法构建AsMYB44系统进化树,用在线软件NCBI Conservation Domain(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)预测分析AsMYB44编码蛋白的结构域和理化性质。

1.5 烟草的遗传转化

利用液氮冻融法将pCAMBIA2300s：AsMYB44重组质粒转入农杆菌EHA105,涂布于LB固体培养基(Kan+Rif),28 ℃培养48 h,挑取菌落进行PCR鉴定。阳性菌落于LB液体培养基(Kan+Rif)中28 ℃、200 r·min-1振荡培养48 h,培养至D600为0.6～0.8;然后采用叶盘法侵染烟草[34],经预培养、共培养、分化培养和生根培养等,得到转基因烟草植株。使用DNAsecure Plant Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取转基因烟草叶片DNA,用AsMYB44基因克隆引物进行PCR检测,筛选阳性植株。

1.6 转录组学和代谢组学联合分析

分别选取3株野生型(WT)烟草、T0代转基因烟草根,将符合质量要求的样本总RNA送至上海派森诺生物科技有限公司进行转录组测序,测序平台为Illumina NovaSeq Pe150,每个样本进行3次重复。测序原始数据经过滤、质控,得到高质量clean reads。将烟草参考基因组(GCF_000715135.1_Ntab-TN90_genomic.fna)与高质量clean reads进行比对组装。组装的unigenes提交至公共数据库进行搜索,与Nr(非冗余核酸序列数据库)、Swiss-Prot(蛋白质序列数据库)、KOG(真核生物蛋白相邻类的聚簇)、GO(http：//www.geneontology.org)、KEGG(http：//www.genome.jp/kegg/)等数据库进行分析比对、基因功能注释和分类。通过FPKM(fragments per kilo bases per million fragments)确定基因表达量,以表达差异倍数|log2Fold Change|>1、显著性P-value<0.05为标准对差异表达基因进行分析。同时,将选取的样本送至武汉迈特维尔生物科技有限公司进行广泛靶向代谢组学分析,每个样本进行3次重复。样品经冻干、提取、LC-MS检测、原始数据处理与质控等过程,得到高质量数据,根据校正后的质谱数据,对代谢物进行鉴定注释、差异代谢物统计与富集注释分析。

1.7 AsMYB44转基因烟草苯丙烷代谢途径关键基因qRT-PCR分析

选取T0代阳性转基因烟草植株,提取根组织总RNA,使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa Code No.6210A)将上述提取的总RNA反转录为cDNA,cDNA稀释100倍备用。苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羟化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：辅酶A连接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基转移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脱氢酶基因(NtCAD)、阿魏酸-5-羟化酶基因(NtF5H)和肉桂酰辅酶A还原酶基因(NtCCR)的qRT-PCR引物见表1,以烟草肌动蛋白(NtActin)基因为内参基因。采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达水平,用Graphpad prims 7.0软件对实验数据进行统计分析、作图,3次生物学重复,取平均值±标准差,对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 AsMYB44克隆与生物信息分析

从当归中分离克隆获得AsMYB44的cDNA序列,其开放阅读框(ORF)为903 bp(图1-A),编码300个氨基酸,预测蛋白质的分子量为33.057 ku,理论等电点为8.84。编码的蛋白质包含PLN03212、MYB domain、SANT结构域(图1-B)。

A,AsMYB44基因克隆;M,DL5000 marker;1～3,当归叶片cDNA为模板的PCR产物。B,结构域分析。C,AsMYB44系统进化分析。A, AsMYB44 gene clone; M, DL5000 marker; 1-3, PCR product of Angelica sinensis leaf cDNA. B, Domain analysis. C, Phylogenetic analysis of AsMYB44.图1 AsMYB44基因克隆、结构域分析和系统进化分析Fig.1 Cloning, domain analysis and phylogenetic analysis of AsMYB44 gene

系统进化树显示,AsMYB44与AtMYB11(AF062863.1)、SmMYB97(KF059561.1)、AtMYB12(AF062864.1)聚到一类,同源性较高(图1-C)。

2.2 植物表达载体的构建与AsMYB44转基因烟草鉴定

将pCAMBIA2300s：AsMYB44植物表达载体转化DH5α,并挑取单克隆进行阳性PCR检测(图2-A),同时测序验证,测序无误菌株提取重组质粒备用。采用冻融法将重组质粒转入根瘤农杆菌EHA105,并对农杆菌菌落进行PCR检测(图2-B),用阳性菌落侵染烟草。对获得的12株T0代转基因烟草植株,提取基因组DNA进行阳性鉴定,共有10株烟草扩增到特异性目的条带,与阳性对照条带大小一致(图2-C)。与野生型烟草对比,AsMYB44转基因烟草无明显表型差异。

A,1～10为大肠埃希菌菌落PCR,11为以AsMYB44质粒为模板的PCR,12为阴性对照;B,1～9为农杆菌菌落PCR,10为以AsMYB44质粒为模板的PCR,11为阴性对照;C,1～12为以转基因烟草DNA为模板的PCR,13为以AsMYB44质粒为模板的PCR,14为阴性对照;M,DL5000 marker。A, 1-10 were PCR products of E. coli colonies, 11 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 12 was negative control; B, 1-9 were PCR products of Agrobacterium colonies, 10 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 11 was negative control; C, 1-12 were PCR products with transgenic tobacco DNA as templates, 13 was PCR product with AsMYB44 plasmid as template, 14 was negative control; M, DL5000 marker.图2 大肠埃希菌菌落、农杆菌菌液与转基因烟草PCR检测Fig.2 PCR detection of Escherichia coli colony, Agrobacterium liquid and transgenic tobacco

2.3 转基因烟草基因和化合物差异表达分析

AsMYB44转基因烟草根转录组学测序共得到124 011 108个clean read。根据每个unigene的FPKM值和log2Fold Change进行差异表达基因筛选,共得到8 084个差异表达基因。与野生型烟草相比,4 119个基因上调,3 965个基因下调(图3-A、图3-B)。KEGG结果显示,34个差异表达基因富集到苯丙烷代谢途径(图3-C)。

A,差异表达基因统计图;B,差异表达基因火山图;C,差异表达基因KEGG富集因子图。A, Statistical map of differentially expressed genes; B, Volcano map of differentially expressed genes; C, Map of KEGG enrichment factors of differentially expressed genes.图3 差异表达基因统计图、火山图、KEGG富集因子图Fig.3 Statistical graph, volcano graph and KEGG enrichment factor graph of differentially expressed genes

AsMYB44转基因烟草根代谢组学分析共检测到1 137个代谢物,其中339个代谢物差异显著,187个上调、152个下调,差异代谢物主要为酚酸、脂质、生物碱、黄酮类等化合物(图4-A)。KEGG分析显示,差异代谢物主要集中于氨基酸、黄酮类、苯丙氨酸等合成代谢途径(图4-B)。

联合转录组学和代谢组学对差异表达基因富集最多的苯丙烷代谢途径进行分析,结果表明,苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羟化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：辅酶A连接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基转移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脱氢酶基因(NtCAD)等结构基因的表达量上调;该途径中差异代谢产物主要为酚酸类化合物,其中,对香豆醛(p-coumaraldehyde)、芥子酸(sinapic acid)、对香豆酸(p-coumaric acid)含量上调显著,而肉桂酸(cinnamic acid)、反式-5-O-对香豆酰莽草酸[trans-5-O-(p-coumaroyl) shikimate]、5-O-对香豆酰奎宁酸(5-O-p-coumaroylquinic acid)含量下调幅度较大(图4-C)。

2.4 苯丙烷代谢途径关键基因qRT-PCR分析

转基因烟草根中,苯丙烷代谢通路中结构基因表达水平显著提高(图5),与转录组学测序结果趋势保持一致。苯丙氨酸解氨酶基因(NtPAL)、肉桂酸-4-羟化酶基因(NtC4H)、4-香豆酸：辅酶A连接酶基因(Nt4CL)、咖啡酸3-O-甲基转移酶基因(NtCOMT)、肉桂醇脱氢酶基因(NtCAD)的相对表达量分别上调2.28、1.63、2.00、3.14、1.56倍,而肉桂酰辅酶A还原酶基因(NtCCR)、阿魏酸-5-羟化酶基因(NtF5H)的相对表达量则下调。

3 讨论

3.1 AsMYB44参与调控当归酚酸类化合物的积累

基于课题组前期的当归不同组织部位转录组数据,从当归中分离出1个与酚酸合成相关的MYB转录因子AsMYB44。系统进化树显示,AsMYB44与AtMYB11(AF062863.1)、SmMYB97(KF059561.1)、AtMYB12 (AF062864.1)聚到一类,同源性较高。丹参中过表达SmMYB97能激活丹参毛状根中酚酸化合物的积累,已证实该基因能激活PAL、C4H、4CL等结构基因的表达量;拟南芥AtMYB11、AtMYB12等转录因子也能通过调控苯丙烷代谢途径中相关结构基因的表达量,进而影响酚酸类化合物的合成代谢[35-38]。而酚酸类化合物是由苯丙氨酸作为底物,AsMYB44过表达转基因烟草中苯丙氨酸途径中的结构基因表达上调也是关键证据之一,由此初步推测AsMYB44可能具备调控植物酚酸类化合物积累的功能。

3.2 过表达AsMYB44影响烟草根部化合物积累

转录组学测序分析表明,与野生型烟草相比,过表达AsMYB44烟草根中差异表达基因主要富集在苯丙烷代谢途径,且该途径中NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCOMT、NtCAD等结构基因的表达量上调。广泛靶向代谢组学的结果显示,差异代谢产物主要为酚酸、脂质、生物碱、黄酮类等化合物,这些化合物作为前体物质,主要参与氨基酸、黄酮类、苯丙氨酸等的合成代谢。苦荞中,FtMYB1、FtMYB2的过表达能促进二氢黄酮醇还原酶(DFR)基因和抑制黄酮醇合酶(FLS)基因的表达量,促进花青素的积累[39];FtMYB13、FtMYB14、FtMYB15、FtMYB16能调控芦丁的代谢合成[40];FtMYB1通过降低黄酮醇合酶基因和鼠李糖基转移酶(RT)基因的表达量抑制黄酮醇的合成[41]。拟南芥中AtMYB111、AtMYB12和AtMYB11能通过促进黄酮醇合酶基因、黄烷酮-3-羟基转移酶基因(F3H)、查尔酮异构酶基因(CHI)和查尔酮合成酶基因(CHS)的表达量,调控黄酮醇的合成与积累[42-44]。苯丙烷代谢途径在植物次生代谢产物的合成代谢中具有重要作用,通过调控苯丙烷代谢途径中相关结构基因的表达量,进而调节相关代谢物的合成代谢[45]。

3.3 烟草中过表达AsMYB44激活苯丙烷代谢途径

与野生型烟草相比,转基因烟草T0代根组织中,苯丙烷代谢途径的NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCOMT、NtCAD、NtCCR等结构基因相对表达量有所提高,而NtF5H下调,该结果与转录组学测序结果趋势保持一致。拟南芥中AtMYB11、AtMYB12通过提高PAL、CHS、FLS、C4H、4CL等基因的表达量,从而调控酚酸的合成代谢。丹参SmMYB52、SmMYB97、SmMYB1、SmMYB52、SmMYB111等转录因子通过正向调控苯丙烷代谢及其下游通路中的PAL、C4H、4CL、TAT、RAS等基因的表达量,以促进酚酸的合成和积累[46-50]。过表达SmMYB36会造成苯丙烷代谢途径及其下游PAL、4CL、TAT等基因表达量降低,负调控酚酸的合成代谢[51]。本研究中AsMYB44功能验证的结果与上述报道相似,AsMYB44转录因子通过正向调节苯丙烷代谢途径中PAL、C4H、4CL、COMT、CAD等基因的表达量,进而影响酚酸等相关化合物的合成代谢;其中,对香豆醛、芥子酸、对香豆酸含量明显上调;肉桂酸、反式-5-O-对香豆酰莽草酸、5-O-对香豆酰奎宁酸含量下降。因此,本研究后续可进一步分析AsMYB44转录因子调控当归酚酸合成的机制。

4 结论

本研究从当归中分离出1个与酚酸合成相关的MYB转录因子AsMYB44,对其进行生物信息学分析,同时利用农杆菌介导的遗传转化体系在Samsun烟草中异源表达并进行多组学联合分析,对其调控次生代谢产物合成的功能进行了验证。结果表明,AsMYB44能通过调控苯丙烷代谢途径中PAL、C4H、4CL、COMT、CAD等基因的表达量,正向调控酚酸的合成代谢,这为当归MYB转录因子调控酚酸等次生代谢物的合成代谢机制研究提供了一定的理论基础。但仍然存在不足之处,后续还需对其更深层次的调控机制进行深入研究。