患白内障病黑斑蛙米尔伊丽莎白菌的分离鉴定与PNGase基因克隆

龚保荣,吴红军,李本镇,徐大洋,邹文腾,曲君艺,鲍传和,朱若林

(安徽农业大学 动物科技学院,安徽 合肥 230036)

黑斑蛙,俗称田鸡、青蛙,是属于无尾目(Anura)蛙科(Ranidae)侧褶蛙属(Pelophylax)的两栖动物。黑斑蛙肉质鲜嫩,富含维生素,具有丰富的营养价值,深受消费者喜爱。目前,中国人工养殖的黑斑蛙已成规模,具有广阔的市场前景[1]。但随着养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高,其病害也频繁发生,给养殖户造成了巨大的经济损失。据报道,黑斑蛙常见疾病包括蛙虹彩病毒病[2]、黑斑蛙蛙病毒病[3]、红腿病、腐皮病、腹水病、水霉病、脑膜炎、白内障等[4]。

2019年以来,安徽舒城地区部分养殖场黑斑蛙出现眼睛白浊甚至出血、运动异常的症状,短期内死亡率达到90%以上。为探明其病因,本研究从病蛙中进行细菌分离和纯化,得到优势菌,通过革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA、gyrB基因检测和进化分析确定该菌的种类,同时对分离菌的PNGase基因进行了克隆和分析,并进行了药敏检测,旨在为该病的确诊和防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2019年7月从安徽舒城某蛙养殖场取回典型患病个体,每只体重为100～150 g。

2×TaqMasterMix (Dye)、6×Superstain Loading Buffer购自北京康为世纪科技有限公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒、T载体、PCR产物快速连接试剂盒、DNA marker购自生工生物工程(上海)股份有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物购自北京兰伯瑞生物技术有限责任公司。M-H琼脂培养基、营养肉汤培养基、革兰氏染液、微量生化鉴定管和抗生素纸片均购于杭州微生物试剂有限公司。

1.2 细菌的分离培养和生理生化鉴定

取典型患白内障病黑斑蛙,用75%乙醇棉球对其体表消毒,在无菌操作台中分别取肝脏、眼睛、脑和脊柱的部分组织,将其横断面在营养琼脂培养基上划线,进行细菌分离操作。将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养24 h,挑取优势菌落重复划线培养,得到形态大小一致的纯菌落。分别挑取一个单菌落进行革兰氏染色,在光学显微镜下观察细菌的颜色和形态。根据Li等[5]将培养好的4株菌接种到9种生化鉴定管中并于28 ℃恒温培养24～48 h进行生化鉴定。各挑取1个单菌落于营养肉汤培养基中,28 ℃振荡培养12 h后,用于后续实验。同时取部分菌液加入终浓度为20%的甘油冻存于-20 ℃冰箱备用。

1.3 16S rRNA和gyrB基因序列测定与系统发育分析

在无菌环境下,挑取单克隆作为模板,以16S rRNA和gyrB通用引物(表1)进行PCR扩增,PCR扩增产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,经胶回收、连接、转化、阳性克隆筛选后,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序得到的16S rRNA序列通过NCBI的BLAST系统进行序列同源性搜索,使用ClustalX 2.0进行多重序列比对,然后使用MEGA 7.0软件采用邻接法构建系统进化树。

表1 米尔伊丽莎白菌16S rRNA和N-糖苷酶引物

1.4 PNGase基因克隆与分析

参考李蒙等[6]及NCBI上FMS-007(GenBank序列号：CP006576)全序列,分别设计了扩增PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因的引物(表1),利用该引物参考1.3节扩增获得PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因全序列,对序列进行测序并构建系统进化树。

1.5 药敏试验

采用Kirby-Bauer纸片扩散法[7],将18种药敏纸片贴于涂有分离菌的M-H固体平板上,并将平板置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h,记录各药敏纸片的抑菌圈直径(mm)。

2 结果与分析

2.1 病蛙的主要症状

病蛙临床表现为运动机能失调、头部歪斜、眼部白浊甚至出血,同时伴有脊柱弯曲等现象,部分蛙腿部发红。解剖后可见肝脏充血肿大、肠道胀气以及脊柱脓肿(图1)。

A,眼睛白浊;B,脊柱脓包;C,眼睛出血;D,肠道胀气。A, Cloudy eyes; B, Spinal pus; C, Eyes bleeded; D, Intestinal flatulence.图1 患病黑斑蛙临床症状Fig.1 Clinical symptoms of diseased Pelophylax nigromaculatus

2.2 细菌分离纯化

从肝脏、眼睛、脑和脊柱等4个部位进行细菌分离和纯化,得到表面整齐、中间隆起的淡黄色单菌落,从中分离出4株优势菌,分别命名为pn1907-1、pn1907-2、pn1907-3、pn1907-4。革兰氏染色结果显示,分离菌均为短杆状的革兰氏阴性菌(图2)。对分离菌的部分生化指标进行了鉴定,结果如表2所示,4株菌生化反应结果与米尔伊丽莎白菌(DSM 14571)完全一致,其中甘油、硫化氢和卵磷脂吐温-80培养基生化反应结果与脑膜炎败血伊丽莎白菌(NCTC 10016)有所不同。

表2 生化鉴定结果

2.3 16S rRNA基因序列测定及系统发育分析

对4株优势菌的16S rRNA进行PCR扩增(图3),测序结果显示,序列长度均为1 479 bp,除极个别碱基外完全一致,表明4株菌为同一种菌。Blast同源性搜索结果显示,该菌与脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica,GenBank序列号：EU128743.1)相似性最高,达到99.96%,其次是米尔伊丽莎白菌(GenBank序列号：CP040516.1),相似性为99.86%。与伊丽莎白菌属的细菌16S rRNA基因序列进行系统发育分析结果显示,分离菌与米尔伊丽莎白菌和脑膜炎败血伊丽莎白菌聚为一分支(图4-A),另有部分脑膜炎伊丽莎白菌聚为另一分支(图4-B)。

M,Marker DL2000;1,pn1907-1;2,pn1907-2;3,pn1907-3;4,pn1907-4;N,阴性对照。M, Marker DL2000; 1, pn1907-1; 2, pn1907-2; 3, pn1907-3; 4, pn1907-4; N, Negative control.图3 16S rRNA的PCR电泳Fig.3 Electrophoresis of 16S rRNA PCR

图4 基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence

2.4 gyrB基因系统发育分析

PCR扩增gyrB基因,测序结果显示,4株菌gyrB基因长度为1 410 bp。Blast同源性搜索结果显示,4株菌与米尔伊丽莎白菌(GenBank序列号：CP040516.1)相似性达100%。与伊丽莎白菌属构建系统进化树,结果如图5所示,分离菌与米尔伊丽莎白菌聚为一分支。

图5 基于gyrB基因序列构建的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on gyrB gene sequence

2.5 PNGase基因检测和系统发育分析

以pn1907-1为对象,通过PCR分别检测了两种PNGase基因(PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ),结果显示,两种PNGase基因均能检测到(图6),测序结果显示,两个基因长度分别为1 475 bp和1 788 bp。BLAST同源性搜索结果显示,PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ与米尔伊丽莎白菌(GenBank序列号：CP040516.1)相似性达100%。与伊丽莎白菌属构建系统进化树,结果如图7、图8所示,分离菌与米尔伊丽莎白菌聚为一分支。

M,DL2000 marker;1,PNGase F;2,PNGase F-Ⅱ;N,阴性对照。M, DL2000 marker; 1, PNGase F; 2, PNGase F-Ⅱ; N, Negative control.图6 PNGase基因的PCR电泳结果Fig.6 Electrophoresis result of PNGase gene

图7 基于PNGase F基因序列构建的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree constructed based on PNGase F gene sequence

图8 基于PNGase F-Ⅱ基因序列构建的系统进化树Fig.8 Phylogenetic tree constructed based on PNGase F-Ⅱ gene sequence

2.6 药敏试验

检测了4株菌对18种药物的敏感性(表3),结果显示,4株菌的药敏结果基本一致： 仅对氟苯尼考敏感;对红霉素、利福平、新生霉素3种药物中介;对青霉素类、头孢菌素类、林可酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类、四环素类、多肽类等14种药物耐药。

表3 四株菌的药敏试验结果

3 讨论

16S rRNA结构和功能上高度保守,可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近[8]。gyrB即促旋酶的B亚单位基因,在信息通路中参与DNA的复制和修复等,在近缘种细菌的区分和鉴定方面具有较高的分辨率[9]。16S rRNA和gyrB是细菌分子生物学鉴定中最常用的两种分子标记。

据报道,蛙白内障的可能病原包括脑膜炎败血伊丽莎白菌[10]、黄杆菌Ⅱ b群[11]、藤黄葡萄球菌、浅黄假单胞菌[12]和肺炎克雷伯菌[13]等,其中大量报道的都是脑膜炎败血伊丽莎白菌[10,14-16]。本研究从患病黑斑蛙中分离到4株优势菌,通过对其16S rRNA序列的同源性比对,结果显示其与脑膜炎败血伊丽莎白菌(GenBank序列号：EU128743.1)的相似性最高,为99.96%,其次是米尔伊丽莎白菌(GenBank序列号：CP040516.1),相似性为99.86%。然而,进化分析结果显示,分离菌与部分脑膜炎败血伊丽莎白菌和米尔伊丽莎白菌聚为一支,而另有一部分脑膜炎败血伊丽莎白菌聚为一支。经查阅文献,伊丽莎白菌属细菌在早期鉴定的过程中,仅用常规的生化鉴定或者16S rRNA基因鉴定经常发生误判。Janda等[17]的结果显示,部分曾被鉴定为脑膜败血伊丽莎白菌的菌株后被证实为按蚊伊丽莎白菌。Hu等[18]的研究显示,部分曾被鉴定为脑膜败血伊丽莎白菌的菌株被证明是米尔伊丽莎白菌。为了进一步确定分离菌的种类,对分离菌的gyrB基因进行了序列分析和比对,BLAST同源性检索结果显示,其与米尔伊丽莎白菌(GenBank序列号：CP040516.1)相似性最高,达100%,基于已有的伊丽莎白菌属gyrB基因序列构建的进化树显示分离菌与米尔伊丽莎白菌聚为一支,而脑膜炎败血伊丽莎白菌聚为另一支,表明分离菌更接近米尔伊丽莎白菌。生化鉴定结果显示,在诸多生化特性上,分离菌与米尔伊丽莎白菌保持一致而与脑膜炎败血伊丽莎白菌相反。加之近年来陆续有从患病两栖动物中分离到米尔伊丽莎白菌的报道[18-20],因此,本研究中从患病黑斑蛙中分离到的4株病原菌为米尔伊丽莎白菌。

米尔伊丽莎白菌于2003年首次在和平空间站冷凝水中发现[6],后被鉴定广泛分布于土壤和水中。2008年美国报道了该菌引起人类感染的首个病例[21],其可引起人类脓毒症[22]、胰腺炎[23]、尿路感染[24]等症状。近些年,在中国和德国有米尔伊丽莎白菌感染蛙类的报道[17,19,25]。Huang等[25]等建立了米尔伊丽莎白菌感染黑斑蛙的模型,研究显示,病原菌主要定殖在宿主的大脑,导致神经源性器官损伤,黑斑蛙在感染米尔伊丽莎白菌后,其抗氧化功能会逐渐减弱,进一步加剧疾病的发生。本研究中患病黑斑蛙脊柱部位出现脓包,并从中分离到大量病原菌,表明脊柱被细菌感染,这可能是导致黑斑蛙神经异常和行动异常的原因之一。

PNGase是一种去糖基化酶,能够专一性地断裂糖链和蛋白之间的酰胺键[26],最早于1977年从杏仁中发现并命名为PNGaseA[27],后发现存在于番茄[28]、稻谷[29]、果蝇[30]、酵母[31]等多种真核生物中,1984年首次从原核生物-脑膜炎败血伊丽莎白菌中分离到,并命名为PNGase F[32],后作为一种工具酶,广泛应用于糖生物学研究[33]。李蒙等[6]从脑膜炎败血伊丽莎白菌(后更正为按蚊伊丽莎白菌)中鉴定到PNGase F和PNGase F-Ⅱ两种糖苷酶的同工酶。本文对分离菌的PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ基因序列进行了克隆和分析,结果表明,分离菌基因组中存在PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ两种同工酶基因。基于这两种同工酶基因序列与伊丽莎白菌属已有菌构建进化树,结果显示,PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ均与米尔伊丽莎白菌聚为一支,与脑膜炎败血伊丽莎白菌相隔较远,印证了16S rRNA和gyrB的结果。此外,基于PNGaseF和PNGaseF-Ⅱ构建的进化树能很好地将伊丽莎白菌属细菌进行聚类,表明其可作为伊丽莎白菌属细菌进行鉴定和聚类分析的保守基因。

药敏试验中,本研究以18种常用抗菌药物对黑斑蛙病原菌进行药物敏感性检测,结果显示,4株分离株仅对氟苯尼考敏感,对3种药物中介,而对另外14种药物耐药,存在多重耐药现象,该结果与雷雪平等[15]的结果一致。在对氟苯尼考的药敏测试中,4株分离菌中的pn1907-1、pn1907-3和pn1907-4的抑菌圈直径很接近,而pn1907-2的抑菌圈明显大很多,表明不同分离株的耐药性有所差异,pn1907-2分离株对氟苯尼考的耐药程度相较其他3株较轻。在本病例中,可使用已批准的氟苯尼考粉和氟苯尼考注射液进行治疗。然而,在蛙类养殖过程中,应注重疫苗预防和中草药治疗,减少抗生素的使用,确需使用抗生素时,需进行药敏检测后再针对性地用药,避免滥用乱用抗生素,减少耐药性的产生。