哈茨木霉LTR-2与产脲节杆菌DnL1-1协同对小麦茎基腐病的防治效果与机理

杨 凯,陈 凯,李红梅,赵忠娟,扈进冬,李纪顺,杨合同

(齐鲁工业大学(山东省科学院)生态研究所,山东省应用微生物重点实验室,山东 济南 250103)

小麦茎基腐病(crown rot)是一种由禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、假禾谷镰孢(F.pseudograminearum)等多种病原菌引起的真菌病害。近年来,受秸秆还田导致的土壤中病原菌增加、栽培品种抗性差、农事操作粗放和气候因素影响,小麦茎基腐病在我国河南、河北、山东、安徽等省份普遍发生,而且呈现不断加重和蔓延趋势[1-2]。引起小麦茎基腐病的病原菌组成比较复杂,随生态环境不同,优势致病菌也不同[3-5],其中由假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病在全世界范围发生[6],中国主要麦区有些重病田小麦损失率高达30%[7]。据调查,近年来黄淮麦区优势致病菌株是假禾谷镰孢[8-10]。

小麦茎基腐病的防治一般有抗病品种选育、农业防治、化学防治和生物防治等措施,其中仍以化学防治为主,但化学药剂的过度使用会带来一系列的环境与食品安全问题。生物防治因其安全、友好、成本低、来源广等优点,成为防治小麦茎基腐病的研究热点,主要菌株有芽孢菌(Bacillusspp.)和木霉(Trichodermaspp.)[11-14]。

目前国际上有关小麦茎基腐病生物防控的相关研究报道较少。Stummer等[14]研究表明,哈茨木霉T.harzianumTr906对假禾谷镰孢的抑制效果显著好于T.gamsiiA5MH。陈凯等[15]研究了深绿木霉T.atrovirideHB20111、哈茨木霉T.harzianumLTR-2和TW21990两两组合共培养发酵对小麦茎基腐病的防治效果,结果发现HB20111+TW21990共培养发酵具有增效作用,对小麦茎基腐病的防治效果显著高于单菌株。本课题组分离鉴定的哈茨木霉T.harzianumLTR-2是一株具有广谱抗真菌活性的生防菌株,产脲节杆菌A.ureafaciensDnL1-1则是一株高效阿特拉津降解菌。前期田间试验发现,连续3 a使用LTR-2菌剂拌种,对小麦茎基腐病的防效达65%以上,优于6%戊唑醇悬浮种衣剂[16]。另有田间小区试验发现,施用LTR-2与DnL1-1混合菌剂,对小麦白穗防效可达63.5%,显著优于施用单一LTR-2菌剂,防效为42.0%(数据未发表)。因此,DnL1-1的存在是否对LTR-2的生防效果具有增效作用,两者协同对假禾谷镰孢的抑菌机理均有待明确。本研究利用盆栽试验测定LTR-2与DnL1-1联合接种对小麦初期茎基腐病的防治效果,并对2种菌株协同防治小麦茎基腐病的作用机理进行了初步探索,以期为小麦茎基腐病生防菌剂的开发应用奠定基础,为小麦茎基腐病的绿色防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试小麦品种为济麦22。生防菌株为本研究室前期筛选获得的高效生防菌哈茨木霉(T.harzianum)LTR-2和高效阿特拉津降解菌产脲节杆菌(A.ureafaciens)DnL1-1。病原真菌为从山东省济南市章丘田间病株上分离获得的假禾谷镰孢(F.pseudograminearum)。以上菌株均在本实验室菌种库中保藏。

1.2 培养基

采用PDA培养基(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、蒸馏水1 L)培养LTR-2和假禾谷镰孢;采用SM培养基[0.5 g K2HPO4,0.2 g MgSO4·7H2O,0.1 g NaCl,0.02 g CaCl2,2 g葡萄糖,10 mL阿特拉津原液(1 mL吐温-80、5 g阿特拉津原药、100 mL蒸馏水),5 mL ZnFe-citrat原液(0.04 g ZnSO4·7H2O、0.4 g FeSO4·7H2O、10 g 柠檬酸钠、100 mL蒸馏水)]活化DnL1-1;采用大米液体培养基培养制备LTR-2、DnL1-1、LTR-2+DnL1-1的发酵液。采用发酵培养基[玉米粉0.2 g·L-1、豆粕粉0.1 g·L-1、(NH4)2SO40.02 g·L-1、KH2PO40.005 g·L-1、K2HPO40.005 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.001 g·L-1]培养假禾谷镰孢。采用YPD培养基(酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、琼脂8 g、蒸馏水1 L)测定假禾谷镰孢分生孢子萌发率。将配制的各类培养基于121 ℃高压灭菌20 min,备用。

1.3 LTR-2与DnL1-1对小麦茎基腐病的防治

1.3.1 试验设计与方法

在温室条件下进行DnL1-1与LTR-2联合接种对小麦茎基腐病的防治效果试验,用假禾谷镰孢对土壤进行预处理,试验设5个处理：CK(空白对照)、酷拉斯(化学处理对照)、LTR-2+DnL1-1、LTR-2、DnL1-1。试验地点为齐鲁工业大学(山东省科学院)彩石校区温室内,试验用土为健康大田土,过筛,准备一次性250 mL纸杯,每杯装入250 g土。

配制发酵培养基,灭菌,接入新鲜的假禾谷镰孢菌饼,25 ℃、150 r·min-1摇床培养7 d,收集发酵液,对发酵液中假禾谷镰孢分生孢子进行计数,调整浓度为106CFU·mL-1。将病菌发酵液分别稀释100倍、50倍、20倍,每个纸杯加入70 mL发酵液,浸润土壤。

用2%次氯酸钠处理种子5 min,用无菌水冲洗3遍,再用75%乙醇处理3 min,用无菌水冲洗5次后,LTR-2、DnL1-1、LTR-2+DnL1-1处理分别用LTR-2孢子悬浮液(108CFU·mL-1)、DnL1-1菌悬液(108CFU·mL-1)和DnL1-1+LTR-2混合菌悬液(108CFU·mL-1)浸种1 h;用酷拉斯(噻虫嗪22.6%、咯菌腈2.2%、苯醚甲环唑2.2%)稀释1 000倍浸种处理作为化学处理对照;用清水浸种处理作为空白对照。处理好的种子均匀播种在纸杯内,每杯10粒,种子上覆盖30 g土。每个处理3次重复,随机区组排列。

1.3.2 小麦幼苗收集

30 d试验结束,收取处理组和对照组的小麦植株,分别测量其株高、根部和地上部鲜重,每处理3次重复,每重复10株。

1.3.3 病害调查

根据小麦第一叶鞘下茎秆褐变长度进行分级[17]：0级,无病;1级,褐变长度占25%以下;2级,褐变长度为25%～<50%;3级,褐变长度为50%～<75%;4级,褐变长度为75%及以上。计算病情指数与防治效果。

I=100 ×∑(G×n)/(Gmax×N);

(1)

E=(ICK-IT)/ICK。

(2)

式(1)、(2)中：I表示病情指数,G表示各病级,n表示病级株数,Gmax表示最高病级,N表示总调查株数;E表示防治效果,ICK表示对照组病情指数,IT表示处理组病情指数。

1.4 LTR-2与DnL1-1对假禾谷镰孢的抑菌作用

1.4.1 平板对峙试验

采用平板对峙法,在PDA平板一侧接种假禾谷镰孢,在对称另一侧分别接种LTR-2、DnL1-1、LTR-2+DnL1-1,同时以不接种生防菌为空白对照,28 ℃恒温培养,每处理重复3次。7 d后测量病原菌半径,计算抑制率。

RI=(rCK-rT)/rCK。

(3)

式(3)中,RI表示抑制率,rCK表示对照处理菌落半径,rT表示处理菌落半径。

1.4.2 LTR-2与DnL1-1对假禾谷镰孢菌丝形态的影响

将LTR-2和假禾谷镰孢分别接种于PDA平板,25 ℃培养14 d,刮取分生孢子,用无菌水制备孢子悬浮液。将菌株DnL1-1接种于SM平板,30 ℃培养3 d,刮取菌落,用无菌水制备菌悬液。将灭菌载玻片置于加有2 mL无菌水浸润的2层灭菌滤纸的9 cm培养皿中,用1 mL移液枪在载玻片上平铺PDA薄板,各取5 μL LTR-2孢子悬浮液和DnL1-1菌悬液单独或联合滴至薄板一端,取5 μL假禾谷镰孢孢子悬浮液滴置薄板另一端,25 ℃培养3 d,观察两端菌接触边缘的菌丝形态。

1.5 LTR-2与DnL1-1发酵滤液对假禾谷镰孢的抑菌机理

1.5.1 LTR-2与DnL1-1发酵滤液制备

挑取活化后的DnL1-1单菌落接种至盛有100 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中,28 ℃、180 r·min-1振荡培养24 h,得到DnL1-1种子液。LTR-2平板于25 ℃培养7 d后,用10 mL无菌水刮洗分生孢子,经灭菌滤纸过滤获得LTR-2孢子种子液。100 mL大米液体培养基中分别接入LTR-2孢子悬浮液1 mL、DnL1-1菌悬液1 mL,或LTR-2孢子悬浮液和+DnL1-1菌悬液各500 μL,以不接种菌为空白对照,28 ℃、180 r·min-1振荡培养7 d。将发酵液4 ℃、10 000×g离心30 min,取上清液,经0.22 μm微孔滤膜过滤,获得DnL1-1、LTR-2、DnL1-1+LTR-2无菌发酵滤液。

1.5.2 发酵滤液对假禾谷镰孢的抑制活性测定

采用牛津杯法测定发酵滤液的生物活性。将0.5 mL假禾谷镰孢孢子悬浮液接种于300 mL PDA培养基中,在接菌的PDA平板上打3个直径5 mm的孔,分别向3个孔内加入50 μL DnL1-1、LTR-2或LTR-2+DnL1-1发酵滤液,以无菌水作为空白对照,每处理3次重复。28 ℃培养5 d,十字交叉法测量抑菌环直径。

1.5.3 发酵滤液处理下假禾谷镰孢菌丝形态和产孢类型观察

分别吸取2 mL DnL1-1、LTR-2、DnL1-1+LTR-2发酵滤液加入1/2发酵培养基中,接入直径5 mm的假禾谷镰孢菌饼,28 ℃、180 r·min-1振荡培养,3 d后在显微镜下观察液体培养状态下的菌丝形态和产孢情况,并用血球计数板对孢子计数。以不接菌的大米培养基发酵滤液加入1/2发酵培养基中培养的假禾谷镰孢作为对照。

1.5.4 发酵滤液处理下假禾谷镰孢孢子萌发率测定

将液体培养的假禾谷镰孢孢子过滤,镜检计数备用。将1.5.1节获得的LTR-2、DnL1-1、LTR-2+DnL1-1无菌发酵滤液各取200 μL与800 μL YPD培养基混匀,倾倒在无菌载玻片上,冷却后均匀涂布100 μL假禾谷镰孢孢子悬浮液(106CFU·mL-1),以添加无菌水的YPD培养基为对照,25 ℃培养,定期观察。当对照的孢子萌发率达80%时,镜检不同处理的孢子萌发情况(以芽管长度超过孢子短半径视为萌发),计算孢子萌发抑制率[15]。

Rg=ng/nt。

(4)

Ig=(Rg,CK-Rg,T)/Rg,CK。

(5)

式(4)、(5)中：Rg表示孢子萌发率,ng表示已萌发孢子数,nt表示总孢子数;Ig表示萌发抑制率,Rg,CK表示对照组孢子萌发率,Rg,T表示处理组孢子萌发率。

1.6 数据分析

采用SPSS19.0软件对数据进行方差分析,用Duncan氏新复极差法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 LTR-2与DnL1-1对小麦茎基腐病的防治效果

2.1.1 对小麦茎基腐病病情指数的影响

盆栽接种假禾谷镰孢发酵液试验结果表明,接种病菌30 d后,盆栽小麦都有不同程度的感染,病菌接种浓度不同,小麦幼苗发病情况也不同。假禾谷镰孢发酵液20倍稀释接种时,空白对照组小麦的病情指数可达79.2,随着接种假禾谷镰孢发酵液浓度的降低,病情指数逐渐降低(表1)。

假禾谷镰孢发酵液100倍、50倍稀释接种时,酷拉斯和LTR-2+DnL1-1处理小麦茎基腐病的病情指数均显著(P<0.05)降低,防治效果分别为88.0%、87.2%和55.6%、50.3%,这两组处理间没有显著差异(P>0.05)(图1)。假禾谷镰孢发酵液100倍稀释接种时,LTR-2+DnL1-1处理的病情指数显著低于LTR-2和DnL1-1单独处理,防效较LTR-2处理提高幅度为50.2%;而50倍稀释接种时,LTR-2+DnL1-1处理的病情指数与LTR-2单独处理相比,没有显著差异,但防效提高幅度为18.8%(图1)。假禾谷镰孢发酵液20倍稀释接种时,与空白对照相比,酷拉斯、LTR-2+DnL1-1和LTR-2处理的病情指数均显著降低,3种处理之间没有显著差异(表1),对小麦茎基腐病的防效分别为34.7%、34.7%、25.9%(图1)。

柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05.图1 LTR-2与DnL1-1对小麦茎基腐病的防治效果Fig.1 Control effect of LTR-2 and DnL1-1 on wheat crown rot

2.1.2 对小麦幼苗生长的影响

接种假禾谷镰孢发酵液20倍稀释液,与空白对照相比,各处理小麦株高没有显著差异,根鲜重和根冠比均显著增加,酷拉斯、LTR-2+DnL1-1、LTR-2和DnL1-1处理的根鲜重分别增加53.6%、59.7%、61.9%和33.1%,根冠比分别增加0.09、0.23、0.21和0.13百分点;除酷拉斯处理的小麦幼苗的鲜重显著增加外,LTR-2+DnL1-1、LTR-2和DnL1-1处理对小麦鲜重没有明显影响(表2)。

表2 假禾谷镰孢20倍稀释接种条件下不同处理对小麦植株生长的影响

2.2 LTR-2与DnL1-1对假禾谷镰孢的抑菌效果

对峙培养3～4 d,LTR-2、LTR-2+DnL1-1处理即表现出对假禾谷镰孢的抑制作用,之后LTR-2继续扩展。第4天LTR-2和假禾谷镰孢之间形成了对抗生长局面,假禾谷镰孢长势明显减弱,第6天与假禾谷镰孢形成了明显的抑菌圈,之后LTR-2向假禾谷镰孢方向扩展,且与假禾谷镰孢之间形成一条明显的拮抗线;第7天LTR-2已侵入假禾谷镰孢,呈包围趋势,假禾谷镰孢在被LTR-2包围后菌落生长出现停滞并出现萎缩现象(图2)。7 d平板对峙培养后,LTR-2、LTR-2+DnL1-1协同对假禾谷镰孢的抑菌率均达到100%,两者之间没有显著差异,而DnL1-1对假禾谷镰孢没有抑菌效果。

A～D分别为对照、DnL1-1、LTR-2、DnL1-1+LTR-2与假禾谷镰孢菌对峙培养7 d。A-D represent the control, DnL1-1, LTR-2 and DnL1-1+LTR-2 confront cultured with Fusarium pseudograminearum for 7 days, respectively.图2 LTR-2与DnL1-1对假禾谷镰孢菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of LTR-2 and DnL1-1 on Fusarium pseudograminearum

2.3 LTR-2与DnL1-1对假禾谷镰孢菌丝形态的影响

将载玻片上对峙培养接触界面处的菌丝置于显微镜下观察发现,对照和DnL1-1对峙处理中,假禾谷镰孢菌丝表面均匀、光滑,隔膜间距较大(图3-A、图3-B);LTR-2与LTR-2+DnL1-1对峙处理中,LTR-2菌丝以缠绕、穿插、紧贴等方式寄生于假禾谷镰孢菌丝上,使假禾谷镰孢菌丝变形,菌丝顶端变细,细胞变短(图3C～图3G),而且菌丝隔膜增多,原生质体浓缩,内容物减少,菌丝从隔膜处断裂、解体,最后假禾谷镰孢停止生长或死亡。

A,空白对照;B,DnL1-1与假禾谷镰孢对峙培养;C、D,LTR-2与假禾谷镰孢对峙培养;E、F、G,LTR-2+DnL1-1与假禾谷镰孢对峙培养。图中黑色箭头所指为LTR-2以缠绕、穿插、紧贴等方式寄生于假禾谷镰孢处,或假禾谷镰孢菌丝原生质浓缩、隔膜增多、细胞变短或菌丝断裂处。A, Control; B, DnL1-1 confront cultured with Fusarium pseudograminearum; C and D, LTR-2 confront cultured with Fusarium pseudograminearum; E, F and G, DnL1-1+LTR-2 confront cultured with Fusarium pseudograminearum. The black arrows in the figure represented that Trichoderma parasitize Fusarium pseudograminearum in ways of twining, penetrating and clinging, and lead to Fusarium pseudograminearum mycelium protoplasm shrinkage, septum increased, cell became shorter or mycelium broke.图3 LTR-2与DnL1-1对假禾谷镰孢菌丝生长的影响Fig.3 Effects of LTR-2 and DnL1-1 on mycelial growth of Fusarium pseudograminearum

2.4 LTR-2与DnL1-1发酵滤液对假禾谷镰孢菌丝生长的抑制作用

从图4可以看出：在LTR-2发酵滤液和DnL1-1+LTR-2共培养发酵滤液的作用下,假禾谷镰孢菌丝生长均受到不同程度的抑制作用;培养2 d时,对照组和DnL1-1发酵滤液处理组的菌丝明显生长较密,气生菌丝生长较快,LTR-2发酵滤液和DnL1-1+LTR-2共培养发酵滤液处理组的菌丝生长较为稀疏,菌丝生长缓慢(图4-A);培养5 d后,LTR-2发酵滤液和DnL1-1+LTR-2共培养发酵滤液处理组在孔径周围出现透明圈,菌丝生长受到抑制(图4-B)。

A、B分别为培养2、5 d的结果,自左向右依次为加入无菌水的对照组,加入DnL1-1发酵滤液、LTR-2发酵滤液、DnL1-1+LTR-2共培养发酵滤液的处理组,上图为正面,下图为反面。A and B represent the results of cultured for 2 and 5 days, respectively. From left to right are the sterile water control group, DnL1-1 fermentation filtrate treatment group, LTR-2 fermentation filtrate treatment group and DnL1-1+LTR-2 combined fermentation filtrate treatment group. The top is the front side, and the bottom is the back side.图4 不同处理发酵滤液对假禾谷镰孢菌丝生长的影响Fig.4 Inhibition of different fermentation filtrates on growth of Fusarium pseudograminearum mycelia

LTR-2发酵滤液和DnL1-1+LTR-2共培养发酵滤液对假禾谷镰孢的抑菌圈直径分别为15.67、19.17 mm,DnL1-1+LTR-2共培养发酵滤液的抑菌效果相对最好,DnL1-1发酵滤液则没有抑菌效果。

2.5 LTR-2与DnL1-1发酵滤液对假禾谷镰孢菌丝形态的影响

DnL1-1的发酵滤液对假禾谷镰孢的菌丝形态没有明显的作用,菌丝形态与对照组一样(图5-A、图5-B),LTR-2的发酵滤液使假禾谷镰孢菌丝膨大畸变、原生质浓缩(图5-C),LTR-2+DnL1-1共培养的发酵滤液同样使假禾谷镰孢菌丝膨大畸变,且菌丝部分从隔膜处断裂(图5-D)。

A,对照(空白发酵滤液+假禾谷镰孢);B,DnL1-1发酵滤液+假禾谷镰孢;C,LTR-2发酵滤液+假禾谷镰孢;D,DnL1-1+LTR-2发酵滤液+假禾谷镰孢。图中黑色箭头所指为菌丝膨大、扭曲或溶断处。A, B, C and D represent the sterile water, DnL1-1 fermentation filtrate, LTR-2 fermentation filtrate and DnL1-1+LTR-2 fermentation filtrate cultured with Fusarium pseudograminearum, respectively. The black arrows in the figure refer to the area where the hyphae expand, twist or fuse.图5 LTR-2与DnL1-1发酵滤液对假禾谷镰孢液体培养中菌丝生长的影响Fig.5 Effects of LTR-2 and DnL1-1 fermentation filtrate on mycelia growth of Fusarium pseudograminearum in liquid culture

进一步通过显微观察发现,菌丝产孢类型发生了明显改变,对照菌丝和DnL1-1发酵滤液处理的菌丝产生的孢子主要为厚垣孢子和分生孢子,而LTR-2发酵滤液和LTR-2+DnL1-1共培养发酵滤液处理的菌丝产生的则主要为分生孢子,无厚垣孢子(图6)。LTR-2+DnL1-1共培养发酵滤液处理产孢量(<104)显著低于其他处理(>105),其他处理间产生的分生孢子量没有显著差异。

A、B,对照(空白发酵滤液+假禾谷镰孢);C,DnL1-1发酵滤液+假禾谷镰孢;D,LTR-2发酵滤液+假禾谷镰孢;E,DnL1-1+LTR-2发酵滤液+假禾谷镰孢。图中黑色箭头所指为不同孢子类型,包括厚垣孢子、分生孢子。A, B, C, D and E represent the sterile water, DnL1-1 fermentation filtrate, LTR-2 fermentation filtrate and DnL1-1+LTR-2 fermentation filtrate cultured with Fusarium pseudograminearum, respectively. The black arrows in the figure indicate different spore types, including chlamydospores and conidia.图6 LTR-2与DnL1-1发酵滤液对假禾谷镰孢液体培养中产孢的影响Fig.6 Effect of LTR-2 and DnL1-1 fermentation filtrate on sporulation of Fusarium pseudograminearum in liquid culture

2.6 LTR-2与DnL1-1发酵滤液对假禾谷镰孢孢子萌发的抑制

25 ℃培养假禾谷镰孢分生孢子,对照组3.5 h孢子萌发率可达80%以上,5 h孢子基本全部萌发。选择3.5 h进行萌发率统计,结果显示,LTR-2+DnL1-1和LTR-2发酵滤液对假禾谷镰孢分生孢子萌发均有明显抑制作用,抑制率分别为43.5%和41.1%;DnL1-1发酵滤液处理与对照组间没有显著差异(图7)。

图7 LTR-2与DnL1-1发酵滤液对假禾谷镰孢分生孢子萌发的影响Fig.7 Effects of LTR-2 and DnL1-1 fermentation filtrate on conidial germination of Fusarium pseudograminearum

3 讨论

小麦茎基腐病近年来已成为我国小麦生产上的重要病害,对小麦安全生产构成严重威胁。有益菌生物防治小麦茎基腐病的研究逐步成为大家关注的热点。Xu等[18]研究发现,枯草芽孢杆菌BacillussubtilisYB-15可以显著降低假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病,防效达81.5%,且能有效促进小麦生长。Zhang等[13]研究发现,贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisYB-185对假禾谷镰孢菌丝生长和孢子萌发表现出较强的抑制作用,且能显著降低小麦茎基腐病的发生,提高小麦籽粒产量。亦有研究表明,菌株复合使用防治效果较单菌株有不同程度的提高[14],但报道仍属少数。

室内盆栽试验表明,LTR-2与DnL1-1协同对假禾谷镰孢的防效显著好于LTR-2单一作用,且与化学药剂酷拉斯处理没有显著差异,这一结果与大田试验结果一致。与小麦地上部生长相比,LTR-2+DnL1-1协同与LTR-2单一处理均能显著促进小麦地下部生长,使小麦根系发达,从而为后期小麦的生长提供营养支撑。平板对峙实验表明,LTR-2+DnL1-1协同与LTR-2单一处理对假禾谷镰孢的抑制作用效果没有显著差异,抑制作用均显著,而DnL1-1对假禾谷镰孢没有抑制作用,DnL1-1不影响LTR-2的抑菌活性。

据报道,木霉具有重寄生、产生抑菌代谢产物等生防机制[19]。本研究中对峙试验显微观察表明,LTR-2和DnL1-1+LTR-2对峙处理中哈茨木霉的菌丝紧贴、穿插或缠绕在假禾谷镰孢的菌丝上生长,同时使病原菌丝原生质浓缩、隔膜增多、菌丝断裂,说明2种处理中主要是木霉的重寄生和抑菌代谢物的作用。另外,生防菌株对病原菌菌丝具有致畸、改变菌丝生长极性、抑制孢子萌发等作用[20-22]。Li等[22]发现,耐盐芽孢杆菌B.halotoleransQTH8培养滤液抑制假禾谷镰孢菌丝径向生长,导致菌丝畸形,如肿瘤形成、菌丝间隔缩短、原生质体凝结、菌丝断裂等,且降低孢子萌发率。本研究发现,LTR-2+DnL1-1和LTR-2的发酵滤液对假禾谷镰孢的菌丝生长抑制作用显著,使病原菌菌丝膨大畸变、原生质浓缩,并逐渐消融、断裂,从而抑制菌丝生长,且能抑制假禾谷镰孢分生孢子的萌发,说明LTR-2+DnL1-1共培养和LTR-2单独培养均能产生相关拮抗物质,从而抑制菌丝生长和孢子萌发,这与其他报道一致。Li等[23]研究发现,与单一培养相比,T.atrovirideSG3403和枯草芽孢杆菌B.subtilis22共培养发酵滤液中抗真菌和促进植物生长的代谢产物均有所增加。共培养中特异性抗真菌和促进植物生长成分的产量增加,可增强两者的生防效果,为生物防治剂的开发提供有效的来源。Li等[24]研究发现,枯草芽孢杆菌B.subtilisC2的培养滤液中存在镰孢菌厚垣孢子诱导活性和抗真菌活性物质,是一种环脂肽凤霉素A,其浓度直接影响镰孢菌菌丝形态和厚垣孢子的形成。因厚垣孢子具有厚壁、抗逆性强的特点,其可在小麦越冬期间保持高存活率,休眠后再次萌发,侵染小麦;降低越冬后孢子存活率,能有效降低茎基腐病的发病率。本实验中LTR-2+DnL1-1和LTR-2的发酵滤液显著影响假禾谷镰孢的产孢类型,2种处理的假禾谷镰孢只产生分生孢子,而不产生厚垣孢子,且共培养处理产生分生孢子量显著低于LTR-2处理,这说明LTR-2可能产生某种抑制假禾谷镰孢厚垣孢子产生的物质,DnL1-1则对这种物质的产量起增效作用。这可能是LTR-2+DnL1-1联合使用的作用效果优于LTR-2单独使用的机制之一。

综上所述,LTR-2与DnL1-1协同对小麦茎基腐病具有很好的防治效果,并能显著促进小麦根系生长;LTR-2与DnL1-1联合可能通过木霉的重寄生作用或协同产生相关拮抗物质,从而抑制假禾谷镰孢菌丝生长和孢子萌发继而达到防控病害的效果,但DnL1-1对于LTR-2在田间防治小麦茎基腐病的增效作用机制还有待进一步研究。