杜仲ABC转运蛋白基因家族成员鉴定与分析

蔡方阳，赵懿琛，*，李 义，赵德刚，3

(1.贵州大学 生命科学学院/茶学院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025； 2.美国康涅狄格大学 转基因植物研究中心，斯托斯 康涅狄格州 06269； 3.贵州省农业科学院 农业农村部植物新品种测试贵阳分中心，贵州 贵阳 550006)

ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)家族庞大、种类繁多，在生物体内广泛存在，目前在大肠埃希菌(Escherichiacoli)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、人类(Homosapiens)中发现的ABC转运蛋白基因数量分别为79、16、30和49[1]，而在植物百脉根(Lotusjaponicus)[2]、拟南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、水稻(Oryzasativa)[4]、烟草(Nicotianatabacum)[5]中发现的ABC转运蛋白基因数量分别为91、130、133、265，远高于动物和微生物，表明在进化过程中植物ABC转运蛋白经历了增殖和功能多样化，帮助植物更好地适应陆地环境[1]。自1992年国际上首次报道从拟南芥中克隆出第1个植物ABC转运蛋白AtPGP1以来[6]，研究人员对植物ABC转运蛋白进行了多方面的研究。ABC转运蛋白分为9个亚家族：ABCA～ABCI，除H亚家族仅分布于昆虫、鱼类、链菌等动物与细菌外，其他均在植物中有分布[7]。这类蛋白结构中普遍含有ATP结合结构域(nucleotide binding domains，NBD)和跨膜结构域(transmembrane domains，TMD)。NBD和TMD共同参与物质的跨膜转运，其中，NBD负责结合ATP并且催化ATP水解释放能量实现底物跨膜运输；而TMD则形成可以供底物通过的跨膜通道。蛋白构像的变化控制物质的转入和转出，其结构域有多种组织形式，含2个NBD和2个TMD为全分子转运蛋白，含有1个NBD和1个TMD为半分子转运蛋白，半分子的ABC转运蛋白通过形成二聚体或多聚体来实现功能，这种二聚体可为同二聚体，又可为异二聚体；NBD和TMD存在于不同的多肽上则称为1/4分子转运蛋白[8-9]。ABC转运蛋白作用的底物类型多样，包括金属与非金属离子、无机酸、脂类、糖类、生物碱、重金属和谷胱甘肽络合物等[10-11]。因其丰富的底物选择性，在植物中ABC转运蛋白功能多样：(1)参与生长素、细胞分裂素、脱落酸和独角金内脂等激素运输。例如ABCB家族成员ABCB1、ABCB4、ABCB14、ABCB15、ABCB19、ABC21有助于生长素的极性运输[12-15]；拟南芥中ABCG家族成员AtABCG14是介导细胞分裂素从根运输到茎的关键蛋白[16]，AtABCG25、AtABCG30、AtABCG31、AtABCG40则参与脱落酸的转运，其中，AtABCG25和AtABCG31负责脱落酸转入，AtABCG30和AtABCG40介导脱落酸输出[17]；矮牵牛和烟草中的ABCG家族成员在独角金内脂的转运中发挥重要作用[1，18]。(2)作用于植物次级代谢产物转运和在特定器官中的积累。例如拟南芥AtABCG11、AtABCG12和AtABCG13帮助角质和角质蜡单体从内质网转运到质膜[19]；AtABCC2参与拟南芥营养组织中液泡转运花青素和其他类黄酮[20]。此外，许多ABC转运蛋白在孢粉素沉积过程中发挥重要作用。在水稻中，OsABCG26在花药中表达，并将角质层单体从绒毡层输送到花药外表面[21]。(3)参与植物抗性应答等生命过程。杨树中ABC转运蛋白基因PtoABCG36在拟南芥中异位表达可提高拟南芥对镉的耐受能力[22]；水稻中OsABCG5调控水稻根的下皮层栓质化过程，这有利于水稻形成生物防御屏障[23]；地毯草AcABCG1基因对金属铝、镉和镧胁迫做出响应[24]。由于ABC转运蛋白具有这样重要的生物学功能，在植物中的研究越来越受到重视，但目前杜仲(EucommiaulmoidesOlive)中关于ABC转运蛋白的研究较少。

杜仲作为重要中药材，其药用成分主要为木脂素类、苯丙素类、环烯醚萜类等次生代谢产物[25-27]，ABC转运蛋白在次生代谢物转运与积累过程中发挥重要作用。本研究在本项目组前期建立的杜仲转录组数据库基础上，通过生物信息学分析方法，对杜仲ABC转运蛋白(EuABCs)家族的分子特征和功能进行预测分析，了解杜仲ABC转运蛋白基因家族的组成、蛋白结构特征与进化关系等基本信息，为进一步深入探究其在次生代谢产物转运方面的功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 杜仲ABC转运蛋白家族成员的鉴定

基于课题组前期构建好的杜仲基因组和转录组数据库[28]，将杜仲转录组序列与NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，筛选出有ABC注释的相关基因，下载其氨基酸序列，再利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和NCBI CDD(http://www.omicsclass.com/article/310)进行结构域分析，筛选出候选序列，利用在线网站ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy. org/protparam/)对EuABCs转运蛋白理化性质进行分析，包括氨基酸序列长度、分子量、理论等电点、不稳定系数、亲水性指数和脂溶性指数等指标。

1.2 杜仲ABC转运蛋白的多序列比对和保守基序分析

将筛选得到的杜仲ABC转运蛋白氨基酸序列采用DNAMan软件进行多序列比对，结合在线工具 meme(http://meme-suite.org/tools/meme)对其保守基序进行预测，并参照李洁[29]、谢小东[5]所提供的ABC蛋白的保守结构域，对其ATP结合结构域的保守基序进行分析。

1.3 杜仲ABC转运蛋白系统发育分析

将检索得到的拟南芥(Arabidopsisthaliana)、毛果杨(Populustrichocarpa)、柚子(Citrusclementina)的ABC转运蛋白氨基酸序列与杜仲ABC转运蛋白氨基酸序列用MEGA-7.0软件构建邻接(NJ，neighbor-joining)系统发育树，对其进化关系进行研究[30]。

1.4 杜仲ABC转运蛋白高级结构预测分析

使用SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.frNPSAnpsa_sopma.html)在线工具预测蛋白质二级结构[31]；通过SWISS-MODEL软件(https://swissmodel.expasy.org/)对蛋白质三级结构进行预测。

1.5 杜仲ABC转运蛋白亚细胞定位与跨膜分析

利用在线工具DeepLoc(http://www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/)对杜仲ABC转运蛋白进行亚细胞定位分析。采用TMHMM Server软件v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜结构预测。

2 结果与分析

2.1 杜仲ABC转运蛋白家族成员的鉴定

根据杜仲转录组序列与NCBI数据库比对后的注释信息，从杜仲蛋白组中下载有ABC注释的氨基酸序列，结合NCBI CDD与Pfam所预测出的保守结构域信息，去除不含注释信息和保守结构域的序列，最终鉴定得到76条杜仲ABC家族蛋白(表1)。理化性质分析结果表明，家族成员间理化性质差异较大，氨基酸序列长度从121 aa到2 196 aa 不等，分子量为13.32～243.19 ku。其中，编码氨基酸序列最长的EuABC52，其分子量也最大，为243.19 ku；EuABC29分子量最小，为13.32 ku。该家族理论等电点为4.9～9.63，等电点大于7的有58个，占总数的76%。成员中稳定蛋白占60%，疏水性蛋白占64%，其中D、E、F家族均为亲水性蛋白，I家族有7个成员为亲水性蛋白，仅EuABC3为疏水性蛋白。

表1 杜仲ABC转运蛋白的理化性质

2.2 杜仲ABC转运蛋白的多序列比对和保守基序分析

对鉴定出的杜仲ABC转运蛋白进行多序列比对发现，杜仲ABC转运蛋白具有保守结构域ATP结合结构域组成元件Walker A、Walker B、Walker C(图1)，表明ATP结合结构域对ABC蛋白的鉴定至关重要。同时，利用MEME程序，预测了杜仲ABC转运蛋白中的10个基序(图2)。EuABC家族中保守基序有所不同，最多的含有7个基序，最少的仅有1个基序，这些保守基序分布的差异可能揭示了这些基序的不同功能。结合多序列比对结果，还从MEME分析中发现，典型的保守结构域ATP结合结构域由基序1、2和3，即WalkerC、WalkerA、Walker B组成。

续表1 Continued Table 1

图2 EuABC转运蛋白保守基序分析

2.3 杜仲ABC转运蛋白的系统进化分析

利用杜仲(76条)、拟南芥(123条)、毛果杨(29条)和柚子(23)ABC家族蛋白序列构建NJ系统发育树，根据进化树的分枝，将杜仲ABC转运蛋白家族成员划分为8个亚家族(A～I)(图3)。在亚家族中，有3个来自A亚族，有19个来自B亚族，C亚族成员有14个，D亚族成员有1个，E亚家族成员有1个，F亚族成员有1个，I亚族成员有8个；G家族中成员最多，有29个，占总蛋白的38%。

红色三角形为杜仲；黑色勾为拟南芥；亮蓝色五角星为柚子；紫色正方形为毛果杨。

2.4 杜仲ABC转运蛋白高级结构预测结果

杜仲ABC转运蛋白的二级结构主要由α螺旋、延伸链、β折叠和无规卷曲组成(表2)，α螺旋占二级结构的比例最大(30.58%～58.78%)，其次是无规卷曲和延伸链，β折叠较少(3.85%～10.74%)。此外，还采用同源模型绘制了EuABCs转运蛋白家族成员的三级结构，同家族之间相似度较高，而不同亚家族间有较明显的差异，部分家族成员结构如图4所示。

A，ABCA家族；B，ABCB家族；C，ABCC家族；D，ABCD家族；E，ABCE家族；F，ABCF；G，ABCG家族；I，ABCI家族。

表2 EuABC转运蛋白二级结构和比例

2.5 杜仲ABC转运蛋白亚细胞定位与跨膜分析

通过蛋白质亚细胞定位预测发现，大部分蛋白质定位于质膜、叶绿体，说明这些蛋白质与物质跨膜运输有关。杜仲ABC转运蛋白75%定位在细胞质膜，10.53%定位在叶绿体膜，5.26%定位在内膜系统的高尔基体膜与核膜，9.21%定位于细胞质基质。有15个成员跨膜数为0，跨膜数最多为15，有18个成员跨膜数为6。此外，杜仲ABC转运蛋白可能在亚细胞定位和跨膜结构中具有亚家族共性，例如A家族成员均定位于细胞质膜且具有跨膜结构；D、E、F家族均不在细胞质膜且无跨膜结构；I家族成员仅EuABC7定位于质膜上，除EuABC7和EuABC21外，均无跨膜结构；G家族成员众多，在细胞膜、细胞质、细胞器膜均有分布，29个成员中有4个不具跨膜结构。部分杜仲ABC转运蛋白亚细胞定位结果见表3。

表3 EuABC蛋白亚细胞定位与跨膜分析

3 结论与讨论

ABC转运蛋白结构非常保守，大多含有跨膜结构域和ATP结合结构域，部分成员无跨膜结构域。其中，跨膜结构域一般由4～6个α-螺旋构成且相似度较低，主要负责底物的结合和转移[32-33]；而ATP结合结构域主要负责结合ATP使其水解，是ABC转运蛋白保守区，由200个氨基酸构成，因其包含3个鉴定其身份的基序(Walker A、Walker B、Walker C)成为ABC转运蛋白家族鉴定的重要依据。由于ABC转运蛋白中ATP结合结构域和跨膜结构域组织形式的多样使得ABC转运蛋白家族成员较多。本次鉴定出的76个杜仲ABC转运蛋白家族成员均具有ATP结合结构域，多数成员含有NATP结合结构域的3个基序元件，但有少部分成员仅具有其中1到2个基序元件；除了这3个基本基序外，还预测到了其他7个基序元件，在各成员间分布有所不同，可能作为其亚家族分类的依据。

进化树分析结果表明，杜仲ABC转运蛋白在进化上可分为8类，其中B、C和G亚族成员较多，分别有19、14、29个，与其他物种ABC家族成员分布相似。G亚族是ABC转运蛋白中最大的亚家族，研究也较多。苜蓿MtABCG10突变体对尖孢镰刀菌的抗性降低，表明MtABCG10可能参与抗性响应过程中与植物抗毒素合成相关的类黄酮水平的调节[34]。谢小东[5]研究表明，烟草NtPDR6蛋白参与独脚金内酯的转运过程。葡萄ABCG亚家族成员VvABCG6、VvABCG11.1、VvABCG15.4和VvABCG11.8基因在无核白葡萄胚珠中表达量远高于有核葡萄，说明ABCG家族成员可能与胚珠败育有关[35]。拟南芥中的AtABCG11可运输植株表面的油脂类和蜡质[36]。前人的研究表明，ABCG家族在植物细胞发育、次生代谢物转运、抗性应答等方面均发挥重要作用，因此，后续可以进一步研究ABCG家族在杜仲细胞发育过程和抗菌肽开发中的作用。

亚细胞定位显示，杜仲ABC转运蛋白多定位于质膜；但有15个ABC家族成员不具跨膜结构，分别位于C、D、E、F、G和I家族中，其中，I家族有6个，G家族有4个，C家族有2个，D、E、F家族均不具跨膜结构，且这15个成员中仅有1个成员定位于细胞质膜，表明ABC转运蛋白并不是都参与转运过程，有些可能调控其他生命活动。例如ABCE家族与酵母RNA酶L抑制剂(RNL)蛋白序列一致，不含跨膜结构域，仅含2个ATP结合结构域，推测植物中的ABCE家族可能参与RNAi过程[37]。ABC转运蛋白家族成员存在较大的功能差异。杜仲ABC转运蛋白氨基酸序列长度从121 aa到2 196 aa不等，等电点范围较大(4.90～9.63)；拟南芥ABC转运蛋白成员间氨基酸长度差异较大，等电点和酸碱值差别也很大[3]。同一物种中的ABC转运蛋白虽然有同源性，但不同氨基酸序列间理化性质及其结构也存在较大差异，导致其功能的多样。

本研究通过对杜仲全基因组ABC基因家族的生物信息学分析，鉴定出76个杜仲ABC转运蛋白，将该基因家族分为8个亚家族，多为不稳定蛋白，主要定位于细胞质膜；15个成员不具跨膜结构域，不具备转运功能；在蛋白质亲疏水、亚细胞定位、跨膜结构预测中有明显的亚家族共性。本研究为进一步探究杜仲ABC基因家族结构及其在次生代谢产物转运中的作用机制提供了依据。