基于枝条和叶片表型性状的掌叶覆盆子种质资源多样性研究

何庆海，刘本同，周政德，方 茹，杨少宗，*

(1.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023； 2.武义县三和林木种植场，浙江 武义 321202)

掌叶覆盆子(RubuschingiiH.H.Hu)，蔷薇科悬钩子属，藤状灌木，叶形掌状，果实近球形，红色[1]，在江苏、安徽、浙江、江西、福建、广西有自然分布，拥有丰富的种质资源，遗传多样性丰富。掌叶覆盆子根、叶、未成熟果实可入药，成熟果实营养成分和生物活性物质含量较高，世界粮农组织1993年将其推荐为世界第3代卫生无公害保健营养水果[2-3]，因此，掌叶覆盆子作为蔷薇科悬钩子属重要的药用植物和经济植物，栽培技术的逐渐成熟，为规模化生产提供了有力保证[4-7]。

掌叶覆盆子的种质资源收集及评价相对比较落后，仅有少量文献报道其表型变异及筛选。游晓庆等[8]通过对不同种源掌叶覆盆子种子和果实表型性状及发芽率研究发现，2个或2个以上种源间果实和种子性状存在差异性；潘彬荣等[9]对掌叶覆盆子优株的生长习性进行调查，选育出不同熟期的掌叶覆盆子优良单株。上述研究阐述了各种源间表型性状的差异性，作出有益选择，但没有进一步揭示不同表型的变异规律，进行差异化的分组评价。

植物表型反映了基因型对环境变化的适应，在长期的压力选择中发生不可逆变化，经稳定遗传后产生新表型，因此，表型变异往往在适应和进化上有重要意义[10]。已有研究采用的表型性状大都是果实和种子性状，选用的资源数量有限，未对掌叶覆盆子植株枝条和叶片性状的多样性进行研究。在表型特征中，枝条和叶片性状的变异是遗传变异的重要特征之一，也是植物分类的重要参考指标。枝条和叶片是植物营养生长过程中承担着营养物质生产和运输的功能，对植物生长具有重要作用。本试验以前期选育的20份掌叶覆盆子种质为试材，通过对枝条和叶片10个表型性状的观测，分析不同表型性状的变异规律，根据表型数据进行主成分分析和聚类分析，并对不同类别间的表型进行分析评价。以期为掌叶覆盆子资源保存及构建核心种质提供数据基础，同时为掌叶覆盆子新品种的选育和高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018—2020年在浙江省武义县三和林木种植场内进行。前期采集掌叶覆盆子野生种质资源202份，移栽引种野生当年生带根枝条至林木种植场内，进行人工繁育和选择。2018年选择表型性状上具有明显差异的优选种质20份保存，2019年分区设立苗圃进行人工根蘖扩繁并进一步观察，于2020年6月对20份掌叶覆盆子种质的当年生枝条和叶片表型性状进行测量。

1.2 测量方法

通过两年观察，发现叶柄长、叶裂宽、叶脉角和叶裂数在20份不同种质间差别明显，因此选择为叶片性状的观测指标，并观测常见的性状株高(plant height，PH)、地径(ground diameter，GD)、冠幅(crown breadth，CB)、分枝数(Branching number，BN)、叶片长(leaf length，LL)、叶片宽(leaf width，LW)[11-12]。每份种质种植区块内随机选择5丛掌叶覆盆子进行测量，用卷尺测量株高、冠幅，游标卡尺测量地径，并记录每丛的分枝情况。每丛随机选择一根枝条上的第4～6片叶子拍照留存，使用Image J软件[13]测量叶片长、叶片宽、叶柄长(Petiole length，PL)、叶裂宽(width of leaf lobes，LLW)、叶脉角(leaf vein angle，VA)，并记录叶裂数(number of leaf lobes，LLN)。

1.3 数据处理与统计分析

计算掌叶覆盆子表型性状的平均值、标准偏差和变异系数(CV)，CV=标准偏差/平均值。对表型性状进行主成分分析[14-15]，按照累计贡献率大于85%或特征值大于1提取主成分，并进行聚类分析。对不同组别间掌叶覆盆子的表型性状进行组间方差分析，比较各组在不同表型性状间的差异性。利用Excel 2010和SPSS 19.0软件进行数据处理与分析，图形可视化利用Origin 8.5实现。

2 结果与分析

2.1 掌叶覆盆子表型性状的变异分析

掌叶覆盆子的变异系数如表1和表2所示，表1展示的是观测性状总体的变异系数，表2展示的是不同种质内的变异系数。由表1可以发现，变异系数最大的是分枝数46.63%，最小的是叶脉角10.22%。分枝数越高表明掌叶覆盆子的根蘖系数越高，也直接关系到掌叶覆盆子的产量。分枝数的多少受栽培环境等的因素影响，从变异系数可以看出掌叶覆盆子的分枝数变异非常丰富。

表1 掌叶覆盆子不同性状的变异系数

表2 掌叶覆盆子不同种质性状的变异系数

结合表2来看，分枝数在种质内的变异系数同样很高，最高的为RC06号(81.31%)，最低的为RC17号(22.82%)。在优选种质内，株高的变异系数幅度为3.89%～16.12%；地径4.18%～29.06%；冠幅11.15%～34.05%；分枝数22.82%～81.31%；叶片长3.11%～16.55%；叶片宽4.30%～23.30%；叶柄长1.46%～25.05%；叶裂宽7.48%～46.93%；叶脉角4.77%～15.92%；叶裂数0～19.37%。变异系数的大小，表明该性状在优选种质内的稳定性和一致性，这是新品种申报的重要指标。根据变异系数的大小，对栽培性状进行进一步选择，筛选性状更为一致的种质。

2.2 掌叶覆盆子表型性状的主成分分析

根据掌叶覆盆子的表型性状平均值，在优选种质间进行主成分分析。根据各主成分的载荷矩阵与特征值计算得到主成分的特征向量(表3)。主成分分析中前3个主成分的特征值大于1，提取前三个主成分进行分析(表4)。前3个主成分的累计贡献率为79.04%。第1主成分的贡献率为42.61%，除叶脉角外，其余表型性状均为正向指标，表明第一主成分能够反映出大部分性状情况，叶片长、叶片宽和叶柄长为主要贡献。第2主成分的贡献率为20.52%，叶片长、叶片宽、叶裂宽、叶裂数为负向指标，株高、地径、冠幅和分枝数为主要贡献的性状。第3主成分的贡献率为15.91%，其中叶脉角的载荷值最大为0.78，表明其对该主成分起到主要贡献。因此，将优选种质的10个表型性状，综合成3个主成分。

表4 各主成分的特征值及方差贡献率

根据表3，构建各主成分成分得分与表型性状之间的线性关系式：

表3 各主成分的载荷矩阵和特征向量

F1=0.06VPH+0.17VGD+0.09VCB+0.06VBN+0.23VLL+0.22VLW+0.20VLS+0.16VLLW-0.03VVA+0.17VLLN；

(1)

F2=0.29VPH+0.15VGD+0.31VCB+0.37VBN-0.02VLL-0.10VLW+0.07VLS-0.23VLLW+0.19VVA-0.20VLLN；

(2)

F3=0.35VPH-0.04VGD-0.31VCB-0.20VBN+0.09VLL+0.08VLW+0.03VLS+0.24VLLW+0.49VVA-0.23VLLN。

(3)

式(1)～(3)中：F1、F2、F3分别表示第一主成分、第二主成分、第三主成分的得分；VPH、VGD、VCB、VBN、VLL、VLW、VLS、VLLW、VVA、VLLN分别表示PH、GD、CB、BN、LL、LW、LS、LLW、VA、LLN的值。

2.3 掌叶覆盆子优选种质的聚类分析

根据主成分分析计算出的得分，对20份优选种质进行聚类分析，如图1所示。当欧氏距离(Euclidean distance)等于15时，20份掌叶覆盆子种质被分成3类。第Ⅰ类包含10份，RC03、RC05、RC06、RC07、RC08、RC09、RC10、RC11、RC18、RC20；第Ⅱ类包含9份，RC02、RC04、RC12、RC13、RC14、RC15、RC16、RC17、RC19；第Ⅲ类只有一个RC01。对3类表型性状进行方差分析(表5)，发现株高PH的均值依次为Ⅱ类(1.91 m)>Ⅲ类(1.86 m)>Ⅰ类(1.76 m)，3类间没有显著差异(P>0.05)；地径GD均值依次为Ⅲ类(19.20 mm)>Ⅰ类(17.00 mm)>Ⅱ类(15.65 mm)，Ⅲ类显著(P<0.05)高于Ⅱ类和Ⅰ类。RC01作为单独一类，其株高、冠幅、分枝数与其他两类没有显著差异，其他表型性状的均值较高。Ⅰ类与Ⅱ类组间性状差异主要表现在叶脉角和叶裂数；Ⅰ类与Ⅲ类组间性状差异主要表现在地径、叶片长、叶片宽、叶柄长、叶裂宽和叶脉角；Ⅱ类与Ⅲ类组间性状差异主要表现在地径、叶片长、叶片宽、叶柄长、叶裂宽和叶裂数。不同分组内的性状差异显著，是作为描述组间优选种质差异的重要指示。在表型性状存在丰富变异情况下，有效划分出在优选种质间性状的差异性，可为新品种筛选提供具体可行的选择指标。

表5 不同聚类分组的表型性状差异性分析

图1 掌叶覆盆子优选种质的聚类分析

3 讨论

种质表型性状多样性分析能直接反映农作物商品性、产量等，因此，在筛选优良株系、培育新品种中有着不可替代的作用，同时也被广泛应用于药用植物资源鉴定、遗传多样性分析和核心种质构建[16]。表型性状的丰富变异，在遗传育种中具有重要的选择价值，对育种时亲本选择和探讨种质资源多样性也具有重要的参考价值[17]。掌叶覆盆子种子和果实性状的种源平均变异系数4.67%[8]，明显低于枫香15.83%[18]、槐9.40%[19]、无患子7.34%[20]。相比于种子和果实表型性状的变异系数，掌叶覆盆子枝条和叶片表型性状的变异系数相对较高，为10.22%～46.63%，平均变异系数22.02%，相较于苦瓜24.34%[21]、中型狼尾草17.58%[22]等处于中等水平。变异系数的大小表明性状变异的丰富多样，是作为选择不同品种的重要方式，也是进一步评价新品种的关键步骤。因此，掌叶覆盆子的种子和果实性状在某种程度上并不能有效地描述不同种质间的差异性，采用更多枝条和叶片表型性状的变异评价不同种质，将具有更加广阔的应用价值。

主成分分析作为一个综合指标参与统计计算，在种质资源评价中广泛应用，确定几个最主要的性状因子，更有利于对种质资源进行评价分类[23-24]。根据掌叶覆盆子优选种质表型性状的主成分分析，选取前3个主成分，累计贡献率为79.04%。第1主成分叶片长、叶片宽和叶柄长为主要贡献；第2主成分株高、地径、冠幅和分枝数为主要贡献；第3主成分叶脉角为主要贡献。计算不同优选种质的综合指标得分，进行聚类分析。将20份种质分为三类，分别包含10份、9份和1份种质。掌叶覆盆子的表型聚类分析目前还没有报道，从聚类结果来看，三类种质间的表型性状差别明显。株高和地径是生长的重要指标，PC01的种质地径要显著高于其他两类，是作为区分其他种质资源的重要依据。通过聚类分析后，对不同类别进一步进行差异性分析，可以有效地掌握不同优选种质在表型性状的具体差异，为进一步选择不同优良品种提供了可操作的理论数据支持和评价。

作为蔷薇科悬钩子属重要的药用植物和经济植物，掌叶覆盆子在种质资源收集，遗传改良和新品选育方面也存在较为明显的欠缺。通过对优选种质表型性状观测研究发现，掌叶覆盆子性状的变异较为广泛且丰富，因此，在掌叶覆盆子遗传改良过程中，要充分考虑变异，根据不同的育种目标进行筛选。本研究结果对掌叶覆盆子资源保存及构建核心种质提供数据基础，同时为掌叶覆盆子新品种的选育和高效利用提供参考。