堆肥方式和温度对牛粪堆肥过程中天然类固醇激素降解的影响

王代懿，余 洋，张丰松，李性苑，苟体忠

(1.凯里学院 植物资源综合利用研究所，贵州 凯里 556011； 2.中国地质环境监测院，北京 100081； 3.中国科学院 地理科学与资源研究所，北京100101)

堆肥方式和温度对牛粪堆肥过程中天然类固醇激素降解的影响

王代懿1，余 洋2，张丰松3，*，李性苑1，苟体忠1

(1.凯里学院 植物资源综合利用研究所，贵州 凯里 556011； 2.中国地质环境监测院，北京 100081； 3.中国科学院 地理科学与资源研究所，北京100101)

为了实现畜禽粪便的无害化处理及资源化利用，以新鲜牛粪和木屑作为堆料，采用微型试管堆肥法，模拟研究了好氧和厌氧2种堆肥方式下不同堆肥温度(38、50、70 ℃)对黄体酮、雄烯二酮、17β-雌二醇、雌酮4种天然类固醇激素降解的影响。结果表明，不同温度条件下4种激素在2种堆肥方式下的去除率介于67.6%～100%，其中50 ℃下的去除率为81.9%～100%。4种激素中，雌酮和雄烯二酮在好氧堆肥方式下的去除率优于厌氧堆肥。试验温度(38～70 ℃)对17β-雌二醇、黄体酮和雄烯二酮在牛粪堆肥中的降解影响很小，而在70 ℃的高温堆肥条件下，雌酮的降解受到抑制。在保证堆肥腐熟、杀死有害微生物的前提下，50 ℃下好氧堆肥效果最佳。

天然类固醇激素；堆肥；降解

天然类固醇激素化合物是一类广泛存在于环境中的内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，包括孕激素、雄激素、雌激素和肾上腺皮质激素，在动物和人体内合成，主要通过生物体以排泄的方式进入环境。天然类固醇激素化合物有着极强的内分泌干扰作用，在极低的环境浓度(0.1 ng·L-1)下就可能对生物体造成危害[1-2]。

天然类固醇激素主要通过动物粪便排放，经由养殖废水[3]、环境污水[4]、粪便农用[5]等各种方式进入土壤及水体。在农业生产中，畜禽粪便一直被作为安全高效的有机肥广泛应用。粪便农用可导致天然类固醇激素对土壤的污染，并流失进入地表水和地下水[6-7]。农民在蔬菜、瓜果与有机食品生产中盲目大量地施用有机肥，由此引发的农村面源污染问题已逐渐提上议事日程。一些学者指出，畜禽粪便农用已成为环境中天然类固醇激素的主要来源[8-10]。目前，国内外畜禽粪便的处置方式主要还停留在氮、磷、重金属等常规污染防治和臭气去除方面，重点发展趋势主要集中在资源化，而对于排放的绝大多数天然类固醇激素类内分泌干扰物的防治还依然处于起步阶段，有关畜禽粪便中天然类固醇激素去除方面的研究鲜见报道。对于畜禽粪便的源头处理，目前比较适合我国国情的主流处理方法为堆肥法。为此，本文特选择黄体酮(孕激素)、雄烯二酮(雄激素)、17β-雌二醇和雌酮(雌激素)4种典型天然类固醇激素为研究对象，探索不同堆肥温度在好氧和厌氧条件下对堆肥过程中天然类固醇激素降解的影响，以期为我国农业生产中天然类固醇激素的污染风险防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标准品及堆肥原料

黄体酮(PGT)、雄烯二酮(ADD)、17β-雌二醇(17β-E2)和雌酮(E1)均购于美国Sigma公司，纯度为99.9%。堆肥原料是新鲜牛粪，采集于北京郊区某奶牛场。样品先冷冻干燥，研磨后，过2 mm筛，待用。选用木屑作为牛粪堆肥的调理剂。牛粪的pH值为7.6，电导率(EC)为6.45 mS·cm-1，总氮(TN)含量1.98%，总碳(TC)含量30.27%，含水量45.1%；木屑的TN、TC含量分别为0.17%和45.98%，含水量5.6%。

1.2 堆肥参数及培养实验

堆肥试验采用微型试管堆肥法。堆肥原料(牛粪)和调理剂(木屑)按比例充分混合，获得堆体初始碳氮比(C/N)为30。在堆体中加入去离子水，控制初始含水量为60%。同时，去离子水中分别添加天然类固醇激素标准品(PGT、ADD、17β-E2和E1)，使得堆体中各激素的初始浓度达到2 mg·kg-1(以干质量计)。准确称取5 g堆肥样品于50 mL试管中，分别模拟好氧和厌氧2种堆肥条件。好氧条件下的离心管使用纱布封口，期间每天称重补水；厌氧条件下的离心管中充分通入氮气，使用试管盖密封。设置3组温度(38、50、70 ℃)，将样品分别置于相应条件下的气候培养箱中培养7 d。培养后第7天取样，测定各处理堆肥样品中目标激素残留量，每种处理均设置3个重复。

1.3 天然类固醇激素分析测定

精确称取1.00 g堆肥样品于50 mL聚丙烯刻度离心管中，加入40 μL中间混标储备液作为内标(氘代物内标的标准品以甲醇为溶剂，分别配制成200 μg·mL-1的单标储备液，再把各单标储备液配制成各目标物浓度分别为1 μg·mL-1的中间混标储备液)，再加入20 mL甲醇，涡旋振荡后，超声提取20 min。混合液在12 000 r·min-1高速离心5 min后，取出上清液，重新加入20 mL甲醇，重复2次。合并3次上清液，加入15 mL蒸馏水，再加入30 mL正己烷，弃去上层油脂层，重复1次。40 ℃下水浴旋蒸至约10 mL，加入100 mL蒸馏水稀释。

取上步液体于250 mL锥形瓶中，加入10 mL二氯甲烷，充分振荡，混合均匀，静置分层后超声，取下层溶液至250 mL茄形瓶中。重新加入10 mL二氯甲烷，重复2次，合并3次萃取液。40 ℃水浴下旋转蒸发至近干，加入10 mL甲醇溶解，再加入100 mL蒸馏水稀释。

选用HLB柱(规格为6 mL/500 mg)，6 mL乙酸乙酯、6 mL乙腈、12 mL水活化。将上步水溶液上样，流速5 mL·min-1。10 mL水、5 mL 50%甲醇水溶液清洗，之后通过真空泵高负压抽干30 min。15 mL乙酸乙酯和6 mL乙酸乙酯-乙腈(体积比1∶1)洗脱。将洗脱液收集至40 mL棕色螺旋口存储瓶，氮吹至干，加入2 mL甲醇-乙酸乙酯(体积比4∶6)溶解。

选用NH2柱(规格为3 mL/500 mg)，4 mL甲醇-乙酸乙酯(体积比4∶6)、4 mL水饱和乙酸乙酯活化。将上一步溶解样品上样，自然流速，2 mL甲醇-乙酸乙酯(体积比4∶6)清洗。收集上样溶液和清洗溶液至10 mL尖头试管，氮吹至干。0.2 mL乙酸乙酯涡旋振荡，超声溶解10 s，加入1.8 mL正己烷，混合均匀。

选用Silica柱(规格为3 mL/500 mg)，4 mL水饱和乙酸乙酯、4 mL正己烷-乙酸乙酯(体积比9∶1)活化。将上一步溶解样品上样，自然流速。3 mL正己烷-乙酸乙酯(体积比9∶1)清洗，然后加入6 mL水饱和乙酸乙酯洗脱，洗脱液收集至10 mL尖头试管，氮吹至干，再加入0.5 mL 40%乙腈-0.1%乙酸水溶液，超声溶解10 s，转移至2 mL进样小瓶的内衬管中。

基于液相色谱串联双质谱联用(LC-MS/MS)测定堆肥样品中PGT、ADD、17β-E2和E1的浓度，具体地：0—2 min，用80%的0.1%乙酸(A)和20%的乙腈(B)洗脱，模式为CUR，正负离子分别为30、30；2—6 min，用80%的0.1%乙酸和20%的乙腈洗脱，模式为Gas1，正负离子分别为80、80；6—15 min，用60%的0.1%乙酸和40%的乙腈洗脱，模式为Gas2，正负离子分别为70、70；15—20 min，用60%的0.1%乙酸和40%的乙腈洗脱，模式为IS，正负离子分别为5 500、-4 500；20—25 min，用20%的0.1%乙酸和80%的乙腈洗脱，模式为CAD，正负离子分别为3、3；25 min，用80%的0.1%乙酸和20%的乙腈洗脱，模式为TEM，正负离子分别为550、550。

在堆肥原料中加入去离子水，控制初始含水量为60%，同时，水中添加天然类固醇激素标准品(PGT、ADD、17β-E2、E1)，使得堆体中各激素初始浓度达到50 ng·g-1(以干质量计)。随后按上述分析测定方法进行回收试验。结果表明，该方法堆肥样品中目标激素的最低检测限为0.32～16 ng·g-1，4种激素的回收率平均值分别为108.9%、100.9%、119.5%和95.5%，相对标准偏差分别为10.6%、9.4%、12.0%和8.5%，适合环境样品分析。

2 结果与分析

2.1 堆肥方式的影响

本研究堆肥试验分别在好氧和厌氧2种条件下进行，堆肥温度50 ℃，4种天然类固醇激素在牛粪堆肥中的降解结果见图1。相对于初始浓度2 mg·kg-1，4种天然类固醇激素在厌氧和好氧堆肥条件下的去除率介于81.9%～100%。其中，17β-E2在2种方式下堆肥7 d后，残留浓度均低于仪器检测限，去除率达100%，PGT在厌氧和好氧堆肥条件下的去除率分别为99.89%和99.83%，并且PGT和17β-E2的去除基本不受氧气条件的限制。E1和ADD在堆肥过程中的降解在一定程度上受氧气条件的影响，E1在厌氧和好氧堆肥条件下的去除率分别为81.9%和98.0%，ADD在厌氧和好氧堆肥条件下的去除率分别为96.6%和100%，两者在好氧堆肥下的去除效果均明显优于厌氧堆肥。

有研究报道显示[11]，在用牛粪、猪粪和鸡粪改良的土壤中，E1在牛粪中的降解速率略高于在猪粪和鸡粪中，17β-E2在上述3种粪便改良的土壤中降解速率变化不大。由此可以推理，若对其他类型粪便进行堆肥处理，天然类固醇激素也能达到类似的去除效果。从本试验结果来看，堆肥过程中天然类固醇激素含量大幅降低，4种激素的去除率均达80%以上，尤其是17β-E2的去除率达100%。17β-E2被认为是普遍存在于各类环境介质中，且生物活性最强的一种雌激素[12]。由此可知，好氧堆肥是现阶段去除粪便中天然类固醇激素最经济有效的方法之一。

图1 不同堆肥方式下牛粪中天然类固醇激素的残留浓度Fig.1 Residue concentration of natural hormones in cow dung under different composting manners

2.2 堆肥温度的影响

试验结果(图2)显示，2种堆肥方式3种堆肥温度下，4种目标激素在堆肥中的去除率介于67.6%～100%，其中，E1的去除率介于67.6%～98.0%，17β-E2在3种温度下的去除率均为100%，PGT的去除率介于97.2%～99.9%，ADD的去除率介于96.9%～100%。4种激素中，E1在70 ℃高温下降解率明显降低，厌氧和好氧条件下去除率分别仅为73.3%和67.6%，其余3种激素的降解在试验温度范围内(38～70 ℃)基本不受影响。

温度是影响堆肥系统中微生物活动和工艺过程的重要因素，控制温度的目的在于为微生物营造一个适合的温度环境，以利于其繁殖和降解更多的底物。同时，堆肥温度也是杀灭致病菌、去除水分的关键因素。按照美国环境保护署制定的相关标准[13]，堆体温度在50 ℃以上保持5～7 d或55 ℃条件下保持3 d以上，是杀灭堆肥原料中所含致病微生物，保证堆肥的卫生指标合格和堆体腐熟的重要条件。堆肥中高于70 ℃以上的温度比较罕见，并且对堆肥不利[14]。因此，本研究选择38、50、70 ℃作为控制温度，进行好氧和厌氧条件下的堆肥试验。通常，嗜温菌的最适温度为30～40 ℃，嗜热菌的最适温度为50～60 ℃。在堆肥初期，堆体基本呈中温，嗜温菌得到大量繁殖，它们在利用有机物的过程中不断释放热量，1～2 d即可以使堆体温度达到50～60 ℃。在此温度下，嗜温菌大量死亡，嗜热菌大量繁殖，同时堆体温度明显升高，堆肥发酵进入高温，并在高温范围内稳定一段时间，使得堆肥中的寄生虫和病原菌被杀死，腐殖质开始形成，堆肥达到初步腐熟[15]。

图2 不同堆肥温度下牛粪中E1、17β-E2、PGT和ADD的残留浓度Fig.2 Residual concentration of E1， 17β-E2， PGT and ADD in cow dung under different composting temperature

本研究中，在好氧和厌氧条件下，38 ℃及50 ℃对天然类固醇激素的综合去除效果都较好。综合考虑对堆体中致病菌、虫卵、寄生虫、孢子以及杂草种子的杀灭，为保证堆肥的卫生指标和堆体腐熟，应选择在50℃条件下进行好氧堆肥。

3 小结

本研究表明，当堆肥过度为38～70 ℃，在好氧或厌氧条件下，牛粪中E1、17β-E2、PGT和ADD的去除率介于67.6%～100%，50 ℃的去除率为81.9%～100%。4种激素中，雄烯二酮和雌酮在好氧堆肥方式下的去除率优于厌氧堆肥。试验温度(38～70 ℃)对17β-雌二醇、黄体酮和雄烯二酮在牛粪堆肥中的降解速率影响很小，而在70 ℃的高温堆肥条件下，牛粪中雌酮的降解受到抑制。在去除天然类固醇激素的同时，综合考虑堆肥的卫生指标和堆体腐熟，以50 ℃下进行好氧堆肥的整体效果最好。

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Effectsofcompostingtemperatureandmannerondegradationofnaturalhormonesduringcattlemanurecomposting

WANG Daiyi1， YU Yang2， ZHANG Fengsong3，*， LI Xingyuan1， GOU Tizhong1

(1.InstituteofComprehensiveUtilizationofPlantResources，KailiUniversity，Kaili556011，China; 2.ChinaInstituteofGeo-EnvironmentMonitoring，Beijing100081，China; 3.InstituteofGeographicSciencesandNaturalResourceResearch，Beijing100101，China)

In order to achieve the innocuous treatment and resource utilization of livestock manure， fresh cow dung and straw were used as pile materials. Four types of hormone (progesterone ， androstenedione， 17β-estradiol and estrone) were incubated in cow dung under different temperature (38， 50， 70 ℃) to study the influence of composting temperature on the degradation rate of 4 hormones under either aerobic or anaerobic composting conditions. It was shown that the degradation rate of 4 hormones ranged from 67.6% to 100% under different temperature， and the degradation rate ranged from 81.9% to 100% at 50 ℃. The degradation rate of estrone and androstenedione were higher under aerobic composting than that under anaerobic composting. The tested temperature (38-70 ℃) had little effect on degradation of 17β-estradiol， progesterone and androstenedione in cow dung. But， the degradation of estrone was inhibited under 70 ℃. Giving compost maturity and removal of disease-causing organisms， aerobic composting under 50 ℃ seemed to be the best option.

natural hormones; composting; degradation

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2104-2108

http://www.zjnyxb.cn

王代懿，余洋，张丰松，等. 堆肥方式和温度对牛粪堆肥过程中天然类固醇激素降解的影响[J]. 浙江农业学报，2017，29(12)： 2104-2108.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.20

2017-06-13

环保公益性行业科研专项(201509074)；凯里学院博士科研专项(BS201505)；贵州省科技厅联合基金(黔科合LH字[2015]7752号);分析化学重点学科(院通字[2014]157号)

王代懿(1975—)，女，贵州景屏人，博士，研究方向为畜禽粪便资源化处理及其污染物环境行为。E-mail：wangdaiyi234567@163.com

*通信作者，张丰松，E-mail:zhangfs@igsnrr.ac.cn

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1004-1524(2017)12-2104-05

(责任编辑高 峻)