汞离子对草鱼抗氧化功能的影响

牛景彦，刘占才，2，*

(1.焦作师范高等专科学校 生物技术研究所，河南 焦作 454001； 2.河南师范大学 水产学院，河南 新乡453007)

汞离子对草鱼抗氧化功能的影响

牛景彦1，刘占才1，2，*

(1.焦作师范高等专科学校 生物技术研究所，河南 焦作 454001； 2.河南师范大学 水产学院，河南 新乡453007)

试验将草鱼分为对照组和处理组，对照组置于正常养殖用水中饲养，处理组暴露在Hg2+浓度为0.07、0.22、0.37、0.52 mg·L-1水体中。各组分别于饲养1、5、12、21 d取样，测定鳃、肝胰脏、脾脏和肾脏组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)活性、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。结果显示：与对照组相比，整个试验期内，各组织器官中的SOD、GPx活性(0.52 mg·L-1组)以及GSH含量(0.37、0.52 mg·L-1组)均显著降低(P<0.05)，MDA含量(0.37、0.52 mg·L-1组)显著增加(P<0.05)。暴露1 d时，各组织器官中的SOD、GPx活性(0.07、0.22、0.37 mg·L-1组)和GSH的含量(0.07、0.22 mg·L-1组)均有不同程度的升高，鳃中的MDA含量(0.07、0.22 mg·L-1组)显著下降(P<0.05)。暴露5 d时，0.37 mg·L-1组鳃、脾脏、肾脏中的SOD活性，鳃、肝胰脏、肾脏中的GPx活性，各组织器官中的GSH含量均显著下降(P<0.05)。暴露12 d时，各组织器官中SOD和GPx活性(0.37 mg·L-1组)均显著下降。暴露21 d时，各组织器官中SOD和GPx活性(0.22、0.37 mg·L-1组)以及脾脏和肾脏中的GSH含量(0.22 mg·L-1组)均显著下降(P<0.05)，各组织器官中的MDA含量(0.22 mg·L-1组)均显著增加(P<0.05)。结果表明，低浓度短时间暴露Hg2+对草鱼抗氧化能力有促进作用，高浓度长时间暴露则具有抑制作用；各组织器官对Hg2+的应激反应和各抗氧化组分对Hg2+的应激反应均不尽相同，这可能与脏器和抗氧化组分自身的特点有关，同时也反映出Hg2+毒性作用的复杂性。

Hg2+；草鱼；抗氧化功能

随着我国经济的高速发展，能源、资源的快速消耗，大量含汞废物被排放到环境中，最终随着水循环进入水体[1]。人类活动造成的水体汞污染，已经严重影响了水生生物的生长和发育，甚至导致了水生生物的大量死亡，直接或间接地影响人类的食品安全和健康。近年来，鱼类在评价污染物对生态系统的影响方面的应用越来越多。Almoroth等[2]认为在评价外源污染物对鱼类的影响时，需综合考虑抗氧化机制的响应。Padmini等[3]发现，汞能够诱发鱼体内活性氧自由基(ROS)的产生，引起鱼体抗氧化能力的变化，故其抗氧化功能的变化可以作为汞胁迫的重要指标。虽然许多学者在汞对鱼类抗氧化能力的影响方面开展了研究，但多以个别抗氧化因子作为指标进行评价，少见对鱼类抗氧化能力进行系统的研究[4-6]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)是鱼体内重要的抗氧化酶， 其活性的变化直接影响细胞内ROS和其终末产物脂质过氧化物(LPO) 的含量。还原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)是动物体内重要的抗氧化剂，作为GPx的底物，在动物体内抗氧化代谢中具有重要作用。丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量可以直接反映细胞的脂质过氧化水平和机体受损伤的程度。草鱼(Ctenopharyngodonidella)是我国重要的淡水养殖经济鱼种，用以作为试验动物具有很好的代表性。本试验以草鱼为供试动物，研究了汞暴露情况下草鱼鳃、肝胰脏、脾脏和肾脏组织中SOD、GPx活性，以及GSH和MDA含量的变化，旨在探讨汞污染对草鱼抗氧化功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验草鱼购自新乡市郊某鱼种场，体长(15±2)cm，体质量(110±10)g；置于塑料水箱(100 cm×50 cm×40 cm)中暂养7 d后，挑选体格健壮，规格齐整的草鱼随机分组，进行试验。

HgCl2，分析纯，用双蒸馏水配制成Hg2+浓度为100 mg·L-1母液，根据试验需要稀释成所需浓度。SOD、GPx、GSH、MDA和蛋白质检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 试验处理

采用改进的寇氏法[7]，进行急性毒性实验，计算出Hg2+对草鱼96 h的半致死浓度(LC50)为0.67 mg·L-1。以此为依据，设置 4 个处理组(0.07、0.22、0.37、0.52 mg·L-1)及1个空白对照组，每组50尾草鱼。试验用水为充氧曝气的自来水。养殖水体为：每箱注水100 L，水温26～28 ℃，溶解氧为>5 mg·L-1，pH值为7～8。试验采用静态置换法，每天更换试验水体，各组在整个试验期内，正常投喂。每组2个重复，分别于暴露1、5、12、21 d时取样，每次随机取鱼10尾，取鳃、肝胰脏、脾脏和肾脏等组织待测。

1.2.2 样品处理

在冰水浴条件下，用4 ℃ 0.65% NaCl溶液清洗鳃、肝胰脏、脾脏和肾脏，滤纸吸干，称重，按0.1 g组织加1 mL 4 ℃ 0.65% NaCl溶液的比例，用玻璃匀浆器冰浴匀浆，并于4 ℃，12 000g离心10 min，将上清液保存于-20 ℃冰箱中待测。

1.2.3 抗氧化酶活性测定

SOD、GPx测定均按试剂盒说明进行。SOD 活性(λSOD)单位定义：每毫克组织蛋白在 1 mL 反应液中 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个 SOD 活性单位(U)。GPx活性(λGPx)单位定义：每毫克蛋白催化1微摩尔GSH 所需的GPx的量为一个GPx活性单位(U)。

1.2.4 GSH和MDA含量测定

GSH、MDA测试方法按试剂盒说明进行。GSH 含量定义：每克组织蛋白中GSH的含量(mg·g-1protein)。MDA 含量定义：每毫克组织蛋白中MDA的含量(μmol·mg-1protein)。所有指标吸光值均用 UV-2550 紫外可见分光光度计(日本岛津公司)测定。

1.3 数据处理

所有结果均以平均值±标准差来表示，用SPSS15.0 统计软件对所得数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著性水平设定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1不同浓度Hg2+对SOD活性的影响

从图1可以看出：与对照组相比，暴露1 d，0.07、0.22、0.37 mg·L-1组各器官组织中SOD活性在Hg2+的诱导作用下均有不同程度的升高，随着暴露时间的延长，活性降低；暴露21 d，0.07mg·L-1组SOD活性回落至与对照组相当水平，0.22、0.37 mg·L-1组SOD活性均显著下降(P<0.05)。在整个实验期内，0.52 mg·L-1组各器官组织中SOD活性均受到显著抑制(P<0.05)。

* 表示与对照组差异显著(P<0.05)。下同* meant significant difference at the level of P<0.05 in comparison to control group. The same as below.图1 Hg2+对草鱼器官中SOD活性的影响Fig.1 Effect of Hg2+ on SOD activities in organs of Ctenopharyngodon idella

2.2不同浓度Hg2+对GPx活性的影响

Hg2+对草鱼器官GPx活性的影响见图2。与对照组相比，0.07、0.22、0.37 mg·L-1组GPx活性不同程度地表现为先升后降；暴露1 d，3组各组织器官中GPx活性均有不同程度的升高；暴露5 d，0.37 mg·L-1组肝胰脏、脾脏和肾脏中GPx活性显著下降(P<0.05)；暴露12 d，0.22 mg·L-1组鳃中GPx活性显著下降(P<0.05)，0.37 mg·L-1组各组织器官中GPx活性均显著下降(P<0.05)；暴露21 d，0.22、0.37 mg·L-1组各组织器官中GPx活性均受到显著抑制(P<0.05)。在整个试验期内，0.52 mg·L-1组各器官组织中GPx活性均受到显著抑制(P<0.05)。

2.3不同浓度Hg2+对GSH含量的影响

从图3可以看出：与对照组相比，暴露1 d，0.07、0.22 mg·L-1组各组织器官中GSH含量表现为不同程度的增高；暴露21 d，0.07 mg·L-1组各组织器官和0.22 mg·L-1组鳃、肝胰脏中GSH含量降低至与对照组相当水平，而0.22 mg·L-1组脾脏和肾脏中GSH含量显著下降(P<0.05)。在试验期内，0.37、0.52 mg·L-1组各组织器官中GSH含量显著下降(P<0.05)。

2.4不同浓度Hg2+对MDA含量的影响

Hg2+对草鱼器官MDA含量的影响见图4。可以看出：暴露1 d，0.07、0.22 mg·L-1组鳃中MDA含量显著下降(P<0.05)。暴露21 d，0.07 mg·L-1组各器官组织中MDA含量均与对照组无显著变化(P>0.05)；0.22 mg·L-1组各器官组织中MDA含量均显著升高(P<0.05)。在试验期内，0.37、0.52 mg·L-1组各组织器官中MDA含量均显著升高(P<0.05)。

3 讨论

在正常生理状态下，由于SOD、GPx、GSH等构成的抗氧化系统的作用，机体能够清除正常代谢时产生的ROS，从而维持体内氧化还原状态的动态平衡。研究表明，重金属对生物体的毒性作用是通过改变机体抗氧化系统组分的活性或含量，诱导机体产生过量的ROS，打破机体内固有的氧化还原平衡状态来实现的[8]。本试验中，Hg2+暴露使各组织器官中SOD、GPx活性和GSH含量均发生了不同程度的变化，也从一个侧面证实了这一结论。当机体内ROS激增时，会引起机体的氧化应激反应。在ROS的诱导及机体的代偿应激下，细胞会诱导性地增强抗氧化能力，一般会出现一个过程性的抗氧化酶活性的升高或还原性物质含量的增加现象，这一现象被称为“毒物兴奋作用”[9]。Huang等[10]在研究汞暴露对牙鲆(Paralichthysolivaceus)体内SOD、GPx活性的影响时，也得出了类似的结果。这与本试验中，暴露1 d，0.07、0.22、0.37 mg·L-1组各组织器官中SOD、GPx活性，以及0.07、0.22 mg·L-1组GSH含量升高的现象是一致的。但随着大量ROS对抗氧化系统的消耗，以及细胞代偿作用的减弱，抗氧化酶活性或还原性物质含量会很快降低，与较高浓度的ROS保持新的动态平衡[11]。这可能是0.07 mg·L-1组SOD、GPx活性和GSH含量随暴露时间的延长先升后降，以及0.07、0.22 mg·L-1组肝胰脏、脾脏和肾脏中此3项指标在暴露1 d时均升高，而相对应的MDA含量却没有显著变化的原因。但随着暴露时间的延长和浓度的增加，各组织器官中蓄积的Hg2+对SOD、GPx活性的影响超出了各组织器官的自我修复能力，新的动态平衡被打破[12]，致使各组织器官中的SOD、GPx活性显著受到抑制。有研究发现，GSH可以直接与生物体内的Hg2+和ROS结合，起到解毒作用，从而被不断消耗[13-14]。因此，推测高浓度Hg2+暴露下，草鱼组织内过量的Hg2+、ROS对GSH造成大量消耗，从而导致了0.37、0.52 mg·L-1组在整个实验期内各组织器官中GSH含量的显著下降。

图2 Hg2+对草鱼器官中GPx活性的影响Fig.2 Effect of Hg2+ on GPx activities in organs of Ctenopharyngodon idella

图3 Hg2+对草鱼器官中GSH含量的影响Fig.3 Effect of Hg2+ on GSH contents in organs of Ctenopharyngodon idella

图4 Hg2+对草鱼器官中MDA含量的影响Fig.4 Effect of Hg2+ on MDA contents in organs of Ctenopharyngodon idella

邢桂芳等[15]认为，在高浓度或长时间的暴露下，重金属对生物体抗氧化能力的抑制作用超出自身的修复能力时，会致使体内发生脂质过氧化损伤，导致MDA呈现不断升高。这与本试验中，0.22 mg·L-1组暴露21 d，0.37、0.52 mg·L-1组在整个试验期内MDA含量均显著升高的试验结果相一致。值得注意的是，0.37 mg·L-1组在暴露1 d时，肝胰脏、脾脏和肾脏中MDA含量显著升高，而同时期3脏器中SOD、GPx活性不同程度升高，GSH含量却显著下降的现象。综合考虑，推测此时3脏器产生ROS的速率超出了抗氧化酶及GSH清除的速率，造成了氧化损伤，故其中的MDA含量上升。至于0.07、0.22 mg·L-1组鳃中的MDA含量不升反降，可能是由于草鱼在Hg2+的胁迫下，体内产生的ROS诱导其中的SOD 、GPx活性升高，从而抑制了鳃细胞的脂质过氧化作用，且鳃中SOD活性要比其他器官高，从而导致了其MDA的下降。黄志斐等[16]的研究也佐证了这一推论。

本试验发现，SOD、GPx、GSH对Hg2+胁迫的响应不尽相同。如暴露1 d，0.37 mg·L-1组各组织器官中的SOD、GPx活性均有不同程度的升高，而GSH含量却显著低于对照组水平。同时，各组织器官对Hg2+的应激反应也不尽相同。如暴露12 d，0.22 mg·L-1组鳃中的GPx活性显著低于对照组，而其他组织器官中的GPx活性均与对照组相当。这种差异的存在，表明Hg2+对草鱼体内抗氧化指标的影响与脏器和抗氧化组分自身的特点有关，同时体现了Hg2+毒性作用的复杂性。Ahmad等[13]的研究结果也支持了这一观点。

本试验表明，Hg2+的胁迫能够破坏草鱼抗氧化功能的平衡，进而表现出毒性作用。低浓度短时间暴露对草鱼的抗氧化能力具有促进作用，而高浓度长时间暴露则具有抑制作用。低浓度短时间暴露(0.07 mg·L-1、1 d)鳃中的SOD、GPx活性和GSH、MDA含量均发生显著变化，说明鳃对Hg2+胁迫的响应较其他器官更为敏感。0.37 mg·L-1组各组织器官中MDA含量均显著升高，表明该浓度能够导致草鱼抗氧化能力的下降。

本试验从抗氧化能力的影响方面探究了Hg2+对草鱼的毒性原理，SOD、GPx的活性及GSH、MDA的含量是否适合作为水环境中Hg2+的检测指标还有待下一步的研究，即经接近于水环境的Hg2+浓度处理后，观察草鱼能否做出灵敏的规律性反应。鉴于鳃对Hg2+污染的应激较其他器官更为敏感，今后可以鳃为重点研究对象，采用其他针对性更强的指标，如金属硫蛋白、相关基因等进行试验，进而更加全面地揭示Hg2+的致毒机理。

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(责任编辑卢福庄)

EffectofHg2+onantioxidantfunctionofCtenopharyngodonidella

NIU Jingyan1， LIU Zhancai1，2，*

(1.InstituteofBiotechnology，JiaozuoTeacher’sCollege，Jiaozuo454001，China; 2.CollegeofFisheries，HenanNormalUniversity，Xinxiang453007，China)

This study was aimed to investigate the effect of Hg2+on antioxidant function of grass carp，Ctenopharyngodonidella. The experimental fish were divided into control and treatment groups. The control group fish were fed in normally cultivated water， and the treatment group fish were exposed to water containing Hg2+concentration of 0.07，0.22，0.37，0.52 mg·L-1， respectively. The superoxide dismutase (SOD)， glutathione peroxidase (GPx) activities as well as glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) contents in their gill， hepatopancreas， spleen and kidney were tested on 1， 5， 12， 21 d after treatment. The results were as follows: compared with the control group， during the experimental period， for the tested organ tissues， the SOD， GPx activities(0.52 mg·L-1)and GSH (0.37， 0.52 mg·L-1) contents decreased significantly (P<0.05)， while MDA contents (0.37， 0.52 mg·L-1) increased remarkably(P<0.05). When exposed to Hg2+for 1 d， the SOD， GPx activities (0.07， 0.22， 0.37 mg·L-1groups) and GSH contents (0.07， 0.22 mg·L-1groups) in the tested organ tissues rose in different degree， however， MDA content in gill fell dramatically (P<0.05). When exposed to Hg2+for 5 d， the SOD activities in gill， spleen， kidney (0.37 mg·L-1)， the GPx activities in gill， hepatopancreas， kidney (0.37 mg·L-1)， the GSH contents in the tested organ tissues (0.37 mg·L-1) reduced apparently (P<0.05)， and the same changes took place in the SOD， GPx activities (0.37 mg·L-1) when exposed to Hg2+for 12 d. When exposed to Hg2+for 21 d， the SOD ， GPx activities in the tested organ tissues (0.22， 0.37 mg·L-1) and GSH contents in the spleen and kidney(0.22 mg·L-1) dropped significantly (P<0.05)， nevertheless， MDA contents in the tested organ tissues (0.22 mg·L-1) increased greatly (P<0.05). It could be concluded that for grass carp， the antioxidant function was promoted by low Hg2+concentration in short time exposure， but inhibited by high Hg2+concentration in long time exposure. The experiment showed that the stress responses of the organ tissues and the antioxidant components were not the same under Hg2+stress， this might be due to the characteristics of the organ tissues and the components， but also reflected the complexity of Hg2+toxic effects.

Hg2+;Ctenopharyngodonidella; antioxidant function

S949；Q956

：A

：1004-1524(2017)09-1451-07

牛景彦，刘占才. 汞离子对草鱼抗氧化功能的影响[J].浙江农业学报，2017，29(9): 1451-1457.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.05

2017-02-20

河南省重点科技攻关计划项目(072102130027)；河南省高等学校重点科研项目(18B180017)；河南省教育厅自然科学研究计划项目(2011C180009)

牛景彦(1979—),男,河南新乡人，硕士, 讲师, 主要从事环境效应和水生动物健康研究。E-mail：laoniu526@sohu.com

*通信作者，刘占才，E-mail：zcliu1206@163.com