水杨酸和脯氨酸对盐胁迫下生菜相关基因表达的影响

巫建华，吴中侠，王媛花，冯英娜，*，颜志明，蔡善亚，王全智，孙 颖

(1.江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400； 2.江苏现代园艺工程技术中心，江苏 镇江 212400； 3.睢宁县高作镇农业技术推广服务中心，江苏 徐州 221200)

水杨酸和脯氨酸对盐胁迫下生菜相关基因表达的影响

巫建华1，2，吴中侠3，王媛花1，2，冯英娜1，2，*，颜志明1，2，蔡善亚1，王全智1，2，孙 颖1

(1.江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400； 2.江苏现代园艺工程技术中心，江苏 镇江 212400； 3.睢宁县高作镇农业技术推广服务中心，江苏 徐州 221200)

为了探明水杨酸(SA)和脯氨酸(Pro)在缓解植物盐胁迫中的作用，以生菜品种 ‘美国大叶速生’为材料，采用营养液水培方式，分别使用盐胁迫水培液以及盐胁迫水培液中分别添加SA和Pro 2种外源物质处理生菜幼苗，并且测定相关形态指标、生理指标以及处理后与盐胁迫逆境相关基因的表达量。研究表明，与对照相比，在盐胁迫下加入0.2 mmol·L-1SA和0.2 mmol·L-1Pro处理24 h时，生菜的形态指标缓解效果明显。半定量PCR与荧光定量PCR研究结果基本一致，同时相关抗逆基因LSNCED1、LSNCED2、LSP5CS的表达量在盐胁迫下都有不同程度的上升。结果表明，添加0.2 mmol·L-1SA和0.2 mmol·L-1Pro处理24 h能够缓解盐胁迫对生菜造成的伤害。

盐胁迫；生菜；生理性状；盐胁迫相关基因；基因表达

随着设施蔬菜的发展，过量施用化肥常造成土壤盐分的积累和次生盐渍化的形成。生菜是设施栽培的主要蔬菜之一，土壤盐渍化对生菜优质、高效生产带来不利影响。近年来，通过外源物质，如一氧化氮(nitric monoxide，NO)、CaCl2、Pro、SA、5-氨基乙酰丙酸等[1-2]，来缓解盐胁迫对作物的伤害，已经成为一种克服土壤盐渍化的有效途径。盐胁迫对植物的伤害是多方面的，它可以使植物光合作用受阻、生物产量下降、活性氧过量导致膜完整性的破坏、蛋白质变性、核酸断裂、甚至细胞死亡。研究结果表明，植物受到盐胁迫时体内会合成较高含量的脯氨酸，这些积累的内源脯氨酸可以减轻盐胁迫对植物的伤害。水杨酸(salicylic acid，SA)是植物体内普遍存在的一种酚类化合物，是细胞信号分子，也是一种内源性激素，参与调节植物的许多生理过程。一些研究结果表明，水杨酸具有诱导植物抗病性，提高植物对非生物逆境的抗性，如缓解重金属对植物的毒害作用、提高植物盐胁迫能力等作用[3-4]。

生菜(LactucasativaL.)又名叶用莴苣，属菊科莴苣属，可生食，脆嫩爽口，略甜，深受人们喜爱，已成为我国苏南地区重要栽培蔬菜之一。近年来土壤盐渍化对生菜的生产造成了不同程度的损失。目前关于生菜盐胁迫后的营养生理、干旱方面已有不少研究[5-6]，而有关盐胁迫相关基因的研究较少。本研究通过对盐胁迫以及盐胁迫后添加外源脯氨酸(proline，Pro)和SA后水培液中生菜的生理状态以及相关基因表达的研究，探究外源物质Pro和SA对盐胁迫下生菜的作用机制，旨在为缓解生菜盐害提供理论和技术依据，同时为解决生菜在栽培和育种实践中综合逆境因子的伤害提供新思路。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究所利用的植物材料是生菜品种‘美国大速生’。试验于2015年4月在江苏农林职业技术学院园艺实验基地连栋温室内进行。试验期间温度20～25 ℃，湿度60%～70%，光照5 000～7 000 lx。

1.2 营养液配方

试验共设置5个处理(T1、T2、T3、T4、T5)，以Hoagland营养液作为对照(CK)。生菜幼苗定植于栽培槽中，待生菜培养35 d左右进行如下处理：T1，Hoagland营养液+100 mmol·L-1NaCl；T2，Hoagland营养液+100 mmol·L-1NaCl+0.2 mmol·L-1Pro；T3，Hoagland营养液+100 mmol·L-1NaCl+0.2 mmol·L-1SA；T4， Hoagland营养液+100 mmol·L-1NaCl+0.2 mmol·L-1SA+0.2 mmol·L-1Pro；T5，Hoagland营养液+0.2 mmol·L-1SA+0.2 mmol·L-1Pro。均采用气泵间歇通气培养，每2 d换一次营养液。

1.3 试验方法

1.3.1 不同处理的营养液配方对生菜形态指标的影响

在营养液中处理1、2、6、12、48 h时分别取以上5种处理和对照测定生菜的株高、叶片数、最大叶长、最大叶宽以及根长。测定方法参照《莴苣种质资源描述规范和数据标准》[7]。

1.3.2 不同处理的营养液配方对生菜生理指标的影响

分别测定不同处理以及对照的POD、脯氨酸、丙二醛，使用南京建成生物研究所研发的试剂盒进行测定。

1.3.3 不同处理的营养液配方对耐盐相关基因表达量的影响

采用半定量方法对生菜盐胁迫相关基因进行检测，最终筛选出3个相关基因分别是9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(LSNCED1， GenBank登录号AB120107；LSNCED2 ，GenBank登录号AB120108)、吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(LSP5CS， GenBank登录号AJ715852)。为了进一步验证半定量筛选基因的准确性，采用实时定量的方法进一步准确描述基因的表达量。根据NCBI中公布的基因序列，分别设计几个基因以及内参基因(ACTIN)半定量和荧光定量的引物(表1)。

生菜总RNA提取、消化采用MiniBEST Plant RNA Extraction试剂盒。以总RNA为模板，采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis试剂盒反转录成cDNA，并保存在-20 ℃。

MiniBEST Plant RNA Extraction、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis、荧光染料均购自TaKaRa公司。半定量PCR反应：先用ACTIN基因作为内参，以反转录产物单链cDNA为模板进行PCR扩增，使不同样品所扩增的ACTIN的量一致(以电泳条带的光密度值计量)，进一步确定所需的单链cDNA的模板量，然后进行样品的半定量PCR反应。半定量扩增采用20 μL反应体系，其中PCRmix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O补足至20 μL。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，共29个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。实时荧光定量PCR：应用ABI Step OnePlus 实时定量PCR仪，使用SYBR GreenⅠ(TaKaRa)试剂，扩增体系20 μL包括1 μL cDNA，上、下游引物各0.8 μL，10 μL反应MIX，7.4 μL ddH2O。反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s ，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s ，40个循环。试验设置3次重复，反应结束后分析荧光值变化曲线以及熔解曲线[11-12]。试验数据用ΔΔCt法分析[13]，采用Excel2010绘制柱状图。

表1引物序列及PCR扩增片段大小

Table1Sequence of primers and sizes of PCR amplified products

基因名称CodeNo.引物序列(5'-3')Sequence(5'-3')用途Use参考文献ReferenceLSNCED1GTTGCTCGGTTGGCTTTATTTTTGACGACGGAGTTATCCTTATTTG定量RT-PCRQuantitativeRT-PCR[8]LSNCED2AGAACGAGCTATCGGGAAACCTGGTTCACTTCACAAAGGCAAA定量RT-PCRQuantitativeRT-PCR[8]P5CSCGGGCACCATCACAAAATCGAGGAGAAAACATAGGAGCCAAAA定量RT-PCRQuantitativeRT-PCR[9]ACTINLSNCED1LSNCED2P5CSACTINTTTGCTGGAGATGATGCTCCGTGGTACGACCACTGGCATATGCTCTACAGTCTTCTCCCTTACCGACTTCCCTCCGTCTTTCAACGGCTGACCCAAATGTTTTGTTCACCATCCCTGCTTACTGAAAGGAGGGAAAGAAGCTCACTCGTGGTCCAGAAAATAGTTTGCTGGAGATGATGCTCCGTGGTACGACCACTGGCATA定量RT-PCRQuantitativeRT-PCR半定量PCRSemiquantitativePCR半定量PCRSemiquantitativePCR半定量PCRSemiquantitativePCR半定量PCRSemiquantitativePCR[10][8][8][9][10]

2 结果与分析

2.1不同处理的营养液配方对生菜形态指标的影响

T1处理下，生菜的各个形态指标都比CK组有所下降，其中最大叶宽的变化最明显，在24 h时，最大叶宽为11.20 cm，比对照减少了15.98%；其次是根长，在处理24 h时，根长为23.63 cm，比CK减少了10.15%。与CK相比较， T2处理1～6 h时各指标增加不明显，甚至有的指标出现降低现象；在处理12～24 h，各个指标都有不同程度的增加(表2)，其中处理24 h时增幅较明显的是根长和叶片数，分别比CK增加了9.77%和34.09%。T3处理1～2 h时，各生菜形态指标与CK相比几乎没有变化；处理6～12 h时，根长、最大叶宽和叶片数稍微增加，其他指标没有变化；处理24～48 h时，各个指标比对照都有明显增加，处理24 h时，各个指标增加呈现显著性差异，其中增幅最大的是株高，比对照增加了12.62%，其次是最大叶宽，比对照增加了10.51%。T4处理下，生菜生长状况与CK相比未有明显变化，在处理12～24 h时，生菜各个生长指标都比对照有显著增加，而且在处理24 h时，各个生长指标增幅达到最大；随着处理时间的延长(48 h时)，各个生长指标增幅下降。T5处理下，生菜各个生长指标与CK相比变化不大。

2.2不同处理的营养液配方对生菜生理指标的影响

与CK相比，T1处理1～2 h时，生菜内脯氨酸含量逐渐升高；在处理6 h时脯氨酸含量最低，随着处理的延长脯氨酸含量保持着动态平衡。POD活性在处理1～6 h增加缓慢，随后又逐渐降低，可能是刚受到盐胁迫时，生菜体内的应激反应造成POD活性逐渐升高，随后显著降低。在处理1～12 h时，T1处理的丙二醛含量变化不大；在处理24～48 h时，丙二醛含量骤然上升，表明处理时间的延长造成生菜盐胁迫危害严重。T2处理下，脯氨酸含量高于同期的CK；处理6 h后POD活性显著高于CK，表明外源脯氨酸能够提高POD活性；丙二醛含量在处理1～12 h逐渐降低随后稍微增加，表明脯氨酸能够在一定程度上阻碍膜脂的氧化。T3处理12～48 h时，生菜内脯氨酸含量显著高于对照，表明水杨酸能够一定程度上缓解盐胁迫。T4处理12～48 h时脯氨酸含量逐渐升高；POD活性随着处理时间的延长逐渐升高，在处理24 h时达到最高值；丙二醛在同期处理中含量逐渐降低，在处理12 h时含量最低，表明在这个处理时间段膜脂氧化程度减少。T5处理下，POD活性与MDA含量与CK相比几乎无变化，说明添加外源脯氨酸和水杨酸对未受到盐胁迫生菜无影响。

表2不同处理及不同处理时间对生菜形态指标的影响

Table2Lettuce morphological index in different treatment time

指标Indexes处理Treatment处理时间Treatmenttime/h126122448株高T111.20±0.15b11.20±0.15b5.55±0.82b9.56±0.03b11.47±0.58bc11.35±0.61bcPlantT211.93±0.37ab11.93±0.37ab6.37±0.49b11.57±0.68b12.87±0.67abc13.07±0.34abheight/cmT313.33±0.47ab13.33±0.47ab6.86±0.68b11.16±0.64b15.03±0.54a12.45±0.75abT412.37±0.23a12.37±0.23a5.90±0.20b10.39±0.75b14.00±1.80a14.35±1.53aT512.30±0.12ab12.30±0.12ab10.9±1.01a11.33±0.46b11.03±1.03c10.50±0.87cCK13.60±1.04a13.60±1.04a10.46±1.01a14.43±0.78a13.56±0.74ab12.96±0.58ab叶片数T112.00±0.58a12.00±0.58a14.00±0.58a14.00±0.33b15.00±0.67b15.00±1.00bLeafT212.00±0.67a12.00±0.67a14.00±0.58a13.00±0.00b16.00±0.88b15.00±1.53bnumberT312.00±0.33a12.00±0.33a15.00±0.88a13.00±0.67b15.00±1.00b14.00±0.33bT412.00±0.67a12.00±0.67a14.00±0.33a14.00±0.33b15.00±0.33b15.00±0.88bT512.00±0.33a12.00±0.33a13.00±0.66a13.00±0.33b15.00±0.58b16.00±0.58bCK12.00±3.33a12.00±3.33a14.00±2.87a16.00±2.65a26.00±3.84a22.00±2.02a最大叶长T113.46±0.18b13.46±0.18b12.90±0.95c13.03±0.28c13.50±0.42b13.60±0.47bThelargestT215.40±0.58a15.40±0.58a14.83±0.60ab14.25±0.60bc14.30±0.55ab14.50±0.48ableafT314.65±3.56ab14.65±3.56ab14.03±0.24abc14.20±0.30bc14.16±0.17ab14.20±0.21ablength/cmT415.27±3.49a15.27±3.49a14.20±0.70abc14.56±0.67b13.90±0.72ab14.05±0.75abT514.90±3.71ab14.90±3.71ab13.40±0.15bc13.53±0.18bc14.00±0.40ab13.83±0.15bCK16.06±3.68a16.06±3.68a15.33±0.60a16.00±0.55a15.00±0.71a15.14±0.74a最大叶宽T112.25±0.43bc12.25±0.43bc10.05±1.06c12.17±1.01ab10.50±1.04c10.87±0.94cThelargestT212.20±0.32bc12.20±0.32bc11.81±0.77ab12.80±1.02ab11.83±0.67bc12.55±0.78bleafT313.13±0.54ab13.13±0.54ab12.20±0.30ab12.50±0.06ab12.46±0.03b12.53±0.12bwidth/cmT411.50±0.29c11.50±0.29c11.30±0.25bc11.33±0.44b11.79±0.25bc11.77±0.39bcT511.65±0.25bc11.65±0.25bc10.75±0.62bc11.57±0.30b11.85±0.43bc11.67±0.33abcCK13.90±0.40a13.90±0.40a13.10±0.58a13.51±0.58a14.53±0.95a14.71±0.77a根长T122.80±0.60ab22.80±0.60ab22.30±1.08ab23.50±1.30ab22.63±2.25ab23.25±1.65abRootT224.50±0.60a24.50±0.60a18.43±3.70bc18.95±2.30cd18.86±0.55bc18.9±1.22bLength/cmT319.10±5.00b19.10±5.00b25.45±4.98a25.40±4.87a26.20±5.07a25.65±6.36aT419.45±1.48b19.45±1.48b17.05±1.58c17.00±1.49d18.85±1.47c18.93±1.58bT520.95±0.56ab20.95±0.56ab20.57±0.38bc19.55±0.56bcd18.56±0.52bc18.36±0.19bCK21.70±4.30ab21.70±4.39ab22.33±3.90ab22.46±4.06abc22.90±4.75ab24.5±4.71a

同一指标同一列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

The values of the same index in the same column without the same lowercase letters indicate the significant difference at the level of 0.05. The same as below.

2.3不同处理的营养液配方对耐盐相关基因表达量的影响

2.3.1 盐胁迫对生菜9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(LSNCED)表达的影响

渗透胁迫是盐胁迫作用最先产生的方式[14]，最直接的表现是营养液渗透压增大，导致细胞失水，同时破坏细胞内外渗透压，损坏膜结构，组织细胞分裂和增殖，阻碍生长。NCED基因最初是在玉米(Zeamays)的ABA缺失突变体viviParousj4(vPj4)中克隆得到[15]，其可以特异地氧化裂解9-顺式紫黄质和9-顺式新黄质而产生黄质醛，而并不催化其他种类的类胡萝卜素氧化裂解。随后在拟南芥、番茄、豇豆、菜豆、柑橘、草莓等植物中均克隆到这个基因，NCED基因是一个多基因家族，在植物界中普遍存在并高度保守；在结构上无内含子，氨基酸序列的N-端有典型的叶绿体靶向转运肽，而C-端高度同源，并且有4个保守的组氨酸结构[16]。NCED基因在干旱和盐胁迫诱导下都能表达，且其表达趋势与植物体内ABA含量一致[17]。

表3生菜不同处理时间生理指标

Table3Lettuce physiological indexes in different treatment time

指标Indexes处理Treatment处理时间Treatmenttime/h126122448脯氨酸T1218.70±4.48ab274.64±22.29ab118.64±0.41b144.96±0.74c326.31±35.14abc383.58±35.31ab/(U·mgT2271.57±35.50a284.33±16.73ab371.92±68.97a226.33±19.23b260.38±9.86bc510.50±20.04aprot-1)T3268.14±27.03a257.04±19.36ab114.12±5.52b352.06±7.39a362.12±4.69ab376.91±6.68bT4211.29±13.33ab198.06±11.44c113.52±1.35b213.76±18.49b412.65±60.24a442.79±3.82abT5152.70±20.09b242.78±13.90bc124.38±11.38b226.33±22.19b224.89±19.99c504.20±51.53abCK240.48±0.63a319.01±19.01a122.54±15.39b176.04±8.88b296.19±63.25bc187.02±19.08cPOD/T10.025±0.003ab0.027±0.005ab0.085±0.006a0.073±0.003a0.287±0.073a0.045±0.001b(U·mgT20.028±0.002ab0.014±0.002b0.059±0.003ab0.054±0.002ab0.249±0.029a0.030±0.001bprot-1)T30.016±0.002b0.030±0.001a0.068±0.004ab0.072±0.008a0.071±0.006b0.067±0.004bT40.021±0.000b0.022±0.001ab0.050±0.002b0.061±0.007a0.266±0.025a0.151±0.023aT50.040±0.008a0.030±0.006a0.057±0.002ab0.072±0.005a0.233±0.025a0.054±0.002bCK0.037±0.007a0.029±0.004a0.082±0.001ab0.024±0.001b0.308±0.080a0.133±0.006a丙二醛/T10.011±0.002b0.006±0.001de0.033±0.001ab0.014±0.001a0.012±0.003bc0.019±0.002ab(nmol·mgT20.012±0.001bc0.013±0.001cd0.011±0.001d0.001±0.001c0.013±0.002abc0.016±0.002bprot-1)T30.015±0.004a0.030±0.003a0.003±0.001e0.009±0.001b0.014±0.002ab0.026±0.003abT40.004±0.001c0.019±0.001bc0.031±0.002b0.012±0.002ab0.008±0.002d0.037±0.002aT50.007±0.002b0.025±0.002ab0.025±0.001c0.009±0.001b0.010±0.001c0.023±0.002abCK0.009±0.002b0.004±0.001e0.037±0.001a0.015±0.003a0.015±0.001a0.022±0.001ab

生菜在受到盐胁迫后，体内LSNCED1的表达量发生一定的变化(图2)，在T1处理下，LSNCED1基因的表达量始终高于CK，随着处理时间的延长，LSNCED1基因表达量先升高后降低。这与生菜受到盐胁迫后体内POD活性变化相一致，可能是LSNCED1表达间接地影响POD的产生。在T2处理下，LSNCED1基因表达量呈现波浪式增加，在处理24 h表达量最大，与生菜形态指标增幅相一致，可能是外源脯氨酸在处理24 h促进LSNCED1基因的表达。在T3处理下，LSNCED1基因表达在处理1～6 h始终受到抑制，处理12～48 h时基因的表达量升高，在48 h表达量达到最大，这与在该处理下生菜体内脯氨酸含量变化相一致。在T4处理下，LSNCED1基因在处理1～6 h与对照相比几乎没有变化，在处理12～48 h表达量升高，处理24 h基因表达量最大，随后稍微降低，这与在该处理下生菜内POD活性的变化相符。在T5处理下，LSNCED1基因表达量与CK相比几乎没有变化，生菜的形态指标和生理指标变化几乎与基因表达量相一致(图2)。

在盐胁迫条件下，生菜的LSNCED2基因的表达量变化如图3，与对照相比，随着时间的延长，T1处理的LSNCED2基因表达量在处理1～6 h时高于对照，在处理12～48 h时基因表达量受到抑制，且LSNCED2基因的表达量与生菜体内脯氨酸含量的变化大致相符。T2处理在1～6 h时基因的表达与对照相比几乎没有变化；在处理12～48 h时，基因表达量明显上调，尤其是在处理24 h表达量最大，这与生菜在该处理下各个形态指标变化相似。T3处理的LSNCED2基因表达量先降低随后逐渐升高，在处理24 h时表达量最大，这与生菜POD活性变化类似，可能是因为在盐胁迫下外源水杨酸可以促进POD生成从而清除盐胁迫细胞内活性氧自由基的含量，抑制膜内不饱和脂肪酸的过氧化作用，提高生菜的抗盐胁迫能力。T4处理的LSNCED2基因在处理1～6 h与对照相比没有变化；在处理12～48 h时，基因表达量骤然升高；在处理24 h时表达量呈现显著差异，与生菜形态指标变化相符，可能是LSNCED2间接影响生菜表型的变化。T5处理的LSNCED2基因表达量与对照相比没有多大变化，同时生菜的形态指标和生理指标也未发生较大改变(图3)。

图2 LSNCED1基因在不同处理时间的表达Fig.2 LSNCED1 genes expression in different treatment time

2.3.2 盐胁迫对生菜吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因表达的影响

脯氨酸作为植物体内最重要的胞质渗透调节剂，在细胞受到渗透胁迫时通过大量积累脯氨酸保持细胞与外界环境的渗透平衡[18]。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸合成限速酶，决定植物体内脯氨酸的积累速度[19]。前人通过P5CS基因转化的烟草[20]、水稻[21]、马铃薯[22]、拟南芥[23]等转基因植株中脯氨酸含量比对照高几倍，对干旱、高盐及重金属等逆境胁迫的抗逆性及耐受性显著增强。

生菜在受盐胁迫条件下，体内的LSP5CS基因的表达量变化如图4，在T1处理下，LSP5CS基因表达量在处理1～12 h高于CK，处理24～48 h基因的表达量明显受到抑制，这与该处理下生菜体内脯氨酸含量变化一致。生菜受到盐胁迫后，体内自身合成的脯氨酸维持不了原来的渗透压平衡。在T2处理下，LSP5CS表达量始终高于对照，尤其在处理24 h基因表现出超表达，与生菜体内脯氨酸含量变化一致，表明外源脯氨酸促进盐胁迫生菜体内脯氨酸的积累。在T3处理下，LSP5CS基因表达量在处理1～12 h时与CK相比几乎没有变化，处理24～48 h基因的表达显著高于对照，而且在处理24 h表达量最大，这与生菜在该处理下形态指标的变化趋势相同。在T4处理下，LSP5CS基因在处理1～6 h表达处于抑制状态，在处理12～48 h时，基因的表达量升高，并且在处理24 h表达量最大，随后稍微降低，与该处理下生菜的形态和生理指标的变化一致。在T5处理下，LSP5CS基因表达量与CK相比没有变化，同时生菜的形态和生理指标也未发生较大变化，表明在未受到盐胁迫条件下，外源物质的添加对生菜的生长没有影响(图4)。

图3 LSNCED2基因在不同处理时间的表达Fig.3 LSNCED2 genes expression in different treatment time

图4 LSP5CS基因在不同处理时间的表达Fig.4 LSP5CS genes expression in different treatment time

3 讨论

由9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(NCED)催化的顺-环氧类胡萝卜素向黄养素的转化是高等植物中ABA合成的限速酶[15，24-25]。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸合成途径中的关键酶[26]。大多学者对外源物质对盐胁迫生菜缓解上的研究还停留在生理水平，而对盐胁迫过程生菜相关基因调控研究较少。本试验通过对盐胁迫生菜相关基因的表达和生理指标测定比较分析，得出LSNCED1、LSNCED2基因均在T2处理24 h时表达量最高，说明外源脯氨酸在处理24 h对生菜受到盐胁迫有显著的缓解作用，这与田亚然等[27]、李康等[28]的研究相一致。在T3处理下，LSNCED1基因在处理1～6 h时始终受到抑制，处理12～48 h时基因的表达量升高，在48 h表达量达到最大；LSNCED2基因表达量先抑制随后逐渐升高，在处理24 h时表达量最大。这可能是外源水杨酸促进盐胁迫生菜体内脯氨酸积累间接地影响基因表达，同时也表明了LSNCED1、LSNCED2基因对外源物质的刺激表现得非常灵敏[29]。在T4处理中，LSNCED1、LSNCED2基因在处理1～6 h时，与CK相比没有变化，在处理12～48 h时，LSNCED1、LSNCED2基因表达量骤然升高，同时在处理24 h表达量最大，表明生菜在盐胁迫下加入外源脯氨酸和水杨酸能够显著得到缓解，在这5个处理中，T4处理24 h时，生菜的生理指标、形态指标和相关基因表达优于其他处理的各个时期，可能水杨酸和脯氨酸能够诱导盐胁迫生菜中POD等抗氧化酶活性增加，同时也对抗氧化酶相关基因水平有调控作用。外源水杨酸和脯氨酸能够增加根系长度，说明外源水杨酸和脯氨酸能通过根系生长促进地上部分生长。P5CS基因在T2、T3、T4处理过程中随着处理时间的延长，基因的表达上调，但在各个时间段上调的幅度不同，与报道的大豆[30]、菜豆[31]、甘蔗[32]中P5CS表达特性相同，进一步说明了生菜体内存在着渗透胁迫后脯氨酸积累的适应机制，脯氨酸代谢受P5CS基因转录和翻译水平的调控。

从形态和生理指标来看，在盐胁迫下(T1)，生菜株高、最大叶长、最大叶宽、叶片数、根长随着处理时间延长，均未增长，这与祁向玲[1]对盐胁迫生菜研究的结论一致。加入外源脯氨酸和水杨酸(T2、T3、T4)后，各个生长指标都有相应增长，表现最明显的是在根上，说明外源物质首先促进根的生长，进而作用于地上部分[33-34]。在受到盐胁迫时，脯氨酸含量和POD活性随着处理时间延长逐渐降低，而MDA含量明显升高。在未受到盐胁迫生菜营养液里加入脯氨酸和水杨酸(T5)，生菜各个形态指标变化不明显，没有明显的增长趋势。从生理指标变化来看，外源物质脯氨酸和水杨酸的加入随着时间的延长明显能提高体内脯氨酸含量和POD活性，降低MDA的积累，表明生菜受到盐胁迫时，能够利用外源物质促进体内脯氨酸和POD的生成，维持细胞的渗透平衡，清除体内的自由基，提高抗氧化能力[35-36]。综合基因表达分析，进一步对生理指标的验证，发现二者体现出一致性，也体现了基因表达分析可以成为探索外源物质对盐胁迫生菜缓解的一项依据。下一步将继续对盐胁迫下添加水杨酸和脯氨酸相关基因的互作、时空表达等进行研究，并对盐胁迫下生菜生长保护剂进行进一步试验和发掘。

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(责任编辑张 韵)

Effectofsalicylicacidandprolineongeneexpressionprofilesinresponsetosaltstressinlettuce

WU Jianhua1，2， WU Zhongxia3， WANG Yuanhua1，2， FENG Yingna1，2，*， YAN Zhiming1，2， CAI Shanya1， WANG Quanzhi1，2， SUN Ying1

(1.JiangsuPolytechnicCollegeofAgricultureandForestry，Zhenjiang212400，China; 2.JiangsuEngineeringandTechnologyCenterforModernHorticulture，Zhenjiang212400，China；3.SuiningCountyGaozuoTownAgriculturalTechnologyExtensionServiceCenter，Xuzhou221200，China)

In order to investigate the role of salicylic acid (SA) and proline (Pro) in alleviating salt stress in plants， a lettuce cultivar ‘Meiguodayesusheng’ was used in this study. The lettuce seedlings were grown in hydroponic system under salt stress， and SA and Pro were added to the nutrition solution， respectively. In determination of the morphological and physiological indexes related to salt stress， the results showed that the growth of lettuce seedlings under salt stress was significantly alleviated when treated with 0.2 mmol·L-1SA and 0.2 mmol·L-1Pro for 24 hours. The expression levels of the genes related to salt stress were analyzed by RT-PCR and qRT-PCR，and the expression ofLSNCED1，LSNCED2 andLSP5CSwere remarkably up-regulated under salt stress. These results indicated that 0.2 mmol·L-1SA and 0.2 mmol·L-1Pro could reduce the injury to lettuce caused by salt stress to some extent.

salt stress; lettuce; physiological characteristic; salt-stress related gene; gene expression

S636.2

：A

：1004-1524(2017)09-1489-09

巫建华，吴中侠，王媛花，等. 水杨酸和脯氨酸对盐胁迫下生菜相关基因表达的影响[J].浙江农业学报，2017，29(9)： 1489-1497.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.10

2017-03-04

江苏省农业三新工程(SXGC[2015]311)；江苏高校品牌专业建设工程资助项目 (PPZY2015B173) ；青蓝工程

巫建华(1965—)，男，安徽宣城人，博士，推广研究员，主要从事园艺生产和园艺植物分子生物学研究。E-mail: 932465017@qq.com

*通信作者，冯英娜，E-mail: 503735727@qq.com