一株副乳房链球菌的分离鉴定及生物学分析

任梅渗， 王　印，*， 杨泽晓， 姚学萍， 邬旭龙， 肖　璐

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

一株副乳房链球菌的分离鉴定及生物学分析

任梅渗1，2， 王印1，2，*， 杨泽晓1， 姚学萍1， 邬旭龙1，2， 肖璐1，2

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

摘要：从四川省某大型养殖场病死猪肺脏分离到一株副乳房链球菌，观察该菌株的生长特性、染色特性，进行生化鉴定、药敏鉴定、毒力试验以及16S rRNA基因序列进化树分析。结果显示：该分离株的16S rRNA序列与副乳房链球菌的同源性为99%。分离株在TSA琼脂培养基上呈光滑圆形，半透明的菌落，在血琼脂上呈β溶血；对小鼠的致病性试验测得LD50为2.06×107 cfu·只-1；药敏试验表明，其对头孢类药物较为敏感，对喹诺酮类、四环素类以及氨基糖苷类不敏感。该研究为该菌的临床诊断、疾病预防、选药治疗等奠定了基础。

关键词：副乳房链球菌；猪；16S rRNA；分离鉴定

副乳房链球菌(Streptococcusparauberis)是一种球型、运动性较低、链状排列的革兰氏阳性菌，能引起感染并表现出临床症状，例如出血性败血症、眼球突出症、脑膜炎，恶病质等，在短时间内死亡率超过50%；而且该菌还能引起慢性感染，导致几周内每天都保持较低的死亡率，造成持续死亡[1]。根据以往文献报道，副乳房链球菌能引起牛的乳腺炎，导致牛产品质量下降。在水产养殖业，也有报道该菌引起严重的鱼类疾病，对水产行业造成重大的危害[2]。然而关于该菌的报道大多出现在国外的文献上，尤其是在韩国和日本等地，其引起的疫情频繁发生，严重地影响了当地的养殖行业[3-4]。Whitehead等[5]也在猪上分离到该菌，但是国内对于副乳房链球菌还鲜有报道。本研究从四川省某大型养殖场病死猪肺脏分离到1株副乳房链球菌，根据培养特性、生化鉴定、药敏试验，致病性试验以及16S rRNA序列分析，确定该分离株为1株副乳房链球菌，这为该菌的临床诊断、疾病预防、选药治疗等奠定了基础。

1材料与方法

1.1试验材料

病料采集自四川地区某规模化养猪场。SPF级昆明小鼠30只，体重为18～20 g，雌雄各半，均购自成都达硕生物科技有限公司。

1.2试剂与培养基

TSA培养基、脱纤兔血培养基购自奥博星生物技术(北京)有限责任公司。抗菌药物药敏纸片与细菌微量生化反应管购自杭州微生物试剂有限公司。pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。大肠埃希菌DH5α，2×TaqPCR Master Mix、DNA 分子量标准，标准小牛血清，细菌基因组DNA提取试剂盒以及DNA纯化回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司，其他试剂为国产分析纯。

1.3细菌分离、纯化与培养特性

无菌接种肺脏病料于含有5%小牛血清的TSA培养基，挑取半透明、光滑、圆形，伴有少量荧光的单个菌落进行纯化。将纯化的菌落接种于脱纤兔血培养基，观察溶血形态。

1.4药敏试验

使用药敏纸片扩散法进行测定，依据CLSI标准判定结果。

1.5生化试验

将分离株接种于含有5%小牛血清的TSA琼脂培养基上，按常规方法使用细菌微量生化反应管进行试验，参照伯杰氏细菌鉴定手册[6]判定并分析结果。

1.6测定副乳房链球菌对小鼠LD50

用少量小鼠进行预试验以确定LD100与LD0，在两者之间设置5个剂量梯度，分别为1×109，1×108，1×107，1×106，1×105cfu·mL-1。试验组每组随机取5只小鼠，每只0.2 mL进行腹腔注射，对照组5只小鼠腹腔注射等体积的无菌生理盐水。攻毒后每6 h观察1次，连续观察72 h。剖检死亡小鼠分离致死菌并进行鉴定，用Bliss法计算LD50。

1.7引物设计

参考16S rRNA通用引物序列扩增16S rRNA基因[7]。引物序列为F∶5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R∶5’-GGTTACCTTGTTACGACT-3’，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.816S rRNA基因的扩增与序列分析

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离株基因组。PCR扩增体系共50 μL，具体用量为2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL，RNase-free H2O 20.0 μL，上下游引物各1.5 μL，基因组模板2.0 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反应进行30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用DNA纯化回收试剂盒进行回收，连接pMD19-T载体，转化DH5α，将阳性克隆送交华大科技有限公司测序。测序结果经Blast比对分析，使用DNAStar将该序列与GenBank已登录的副乳房链球菌16S rRNA序列进行同源性比对，构建系统进化树。

2结果与分析

2.1分离株生长特性与镜下形态

该分离株在含有5%小牛血清的TSA琼脂培养基上呈光滑圆形、半透明并且折光检验时伴有微弱荧光的单个菌落；在显微镜下呈链状排列的阳性球菌，有长链也有短链；在含有脱纤兔血琼脂培养基上，菌落周围形成2～3 mm界限分明、透明的溶血环，为β溶血(图1)。

2.2药敏试验结果

分离株在所使用的20种抗菌药物中，对羧苄西林、头孢呋辛以及氯霉素呈高度敏感。对万古霉素、头孢曲松呈中度敏感。对其他抗菌药物均不敏感(表1)，可见分离株对头孢类药物较为敏感，对喹诺酮类、四环素类以及氨基糖苷类不敏感。

图1　副乳房链球菌在血琼脂培养基上的生长特性Fig.1　Growth characteristic of Streptococcus parauberis on blood agar

表1药敏试验结果

Table 1Results of antimicrobial susceptibility tests

药物名称判定标准/mmRS抑菌圈直径/mm敏感性氯霉素≤12≥1820S羧苄西林≤13≥1724S头孢呋辛≤14≥2324S万古霉素≤14≥1714M头孢曲松≤13≥2118M头孢氨苄≤14≥1812R新霉素≤12≥1710R米诺环素≤14≥1912R丁胺卡那≤14≥170R庆大霉素≤12≥150R诺氟沙星≤12≥170R青霉素≤14≥150R苯唑西林≤17≥180R四环素≤11≥150R卡那霉素≤14≥170R丙氟哌酸≤15≥210R氧氟沙星≤12≥160R复方新诺明≤24≥320R多粘菌素≤8≥120R克林霉素≤13≥210R

注: S:敏感；M:中等敏感；R:抗药。

2.3生化特性鉴定

分离株分解葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖、水杨素；不分解卫矛醇、鼠李糖、阿拉伯糖、七叶苷、硫化氢、枸橼酸盐；ONPG、半固体琼脂、尿素为阳性反应；粘液酸、丙二酸、鸟氨酸、精氨酸、苯丙胺试验呈阴性(表2)。参照伯杰氏细菌鉴定手册分析，该分离株符合副乳房链球菌的生化特性。

表2生化试验结果

Table 2Results of biochemical tests

生化试验结果生化试验结果葡萄糖+鼠李糖-水杨素+粘液酸-纤维二糖+硫化氢-麦芽糖+枸橼酸盐-ONPG+七叶苷-半固体琼脂+阿拉伯糖-尿素+鸟氨酸-卫矛醇-精氨酸-丙二酸-苯丙胺-

注: + 表示阳性；- 表示阴性。

2.4对小鼠LD50的测定

接种小鼠后6 h内，各高剂量组小鼠陆续出现精神沉郁、食欲不振、震颤的症状。21 h后，小鼠开始出现死亡，72 h后剩余小鼠基本临床耐过，恢复正常。剖检死亡小鼠可见肝脏、脾脏明显肿大、出血、伴有恶臭。各组小鼠死亡数据为：1×109cfu·mL-1组死亡5只，1×108cfu·mL-1组死亡4只，1×107cfu·mL-1组死亡2只，其他剂量组与对照组均未出现死亡。经计算，分离株对小鼠的LD50为2.06×107cfu·只-1。

2.516S rRNA基因的扩增与序列分析

提取分离株基因组进行16S rRNA扩增，产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增产物片段约为1 500 bp(图2)。将测序结果进行Blast对比分析，结果显示分离株与副乳房链球菌的同源性为99%(分离株16S rRNA序列已上传GenBank，登录号为KT825567)。选取不同来源的副乳房链球菌与猪链球菌、马链球菌、海豚链球菌的16S rRNA序列共同构建系统进化树(图3)，结果同样显示分离株与副乳房链球菌同源性最高，所以判定该分离株为副乳房链球菌。

1: 16S rRNA 扩增目的条带； M: DNA Marker DL2000。图2　16S rRNA PCR扩增结果Fig.2　The result of 16S rRNA by PCR

图3　系统进化树Fig.3　Image of phylogenetic tree

3讨论

副乳房链球菌是一种革兰氏阳性球菌，运动性低，呈链状排列，能引起出血性败血症、恶病质、脑膜炎等疾病。国内对于该菌还鲜有报道，国外的报道主要集中在水产行业、养牛业与食品行业。1996年Domenech等[8]于西班牙首次认定副乳房链球菌是一种鱼类的重要病原菌；2006年Koort等[9]发现该菌也能引起食品行业肉制品的污染。在韩国和日本，该菌是一个主要的致病菌并且对当地水产行业造成了巨大的损失[10-12]。2013年Haines等[13]在北美野生长须鲸中也发现了副乳房链球菌。本研究从病猪分离到致病菌，通过试验鉴定该分离株为副乳房链球菌，这在国内还未见报道。

对于副乳房链球菌致病机制的研究报道还比较少。溶血素作为一种被认知的细菌致病因子，其广泛地存在于革兰氏阳性与阴性细菌中，能溶解红细胞，在由细菌引起的疾病感染过程中起到重要的作用。本研究所分离的副乳房链球菌在血琼脂平板上呈现β溶血，然而以往对该菌的报道多为α溶血或者不溶血[14]，这或许与该分离株对小鼠有较高致病性有关。分析其溶血情况变化的原因可能有几点：第1种可能是由于该溶血素基因发生了突变，导致氨基酸序列变化，从而导致表达出的溶血特性发生变化；第2种可能是由于不同菌株之间溶血素的基因出现水平转移[15]，从而产生变化。

由于国内对副乳房链球菌还缺乏相关报道。本研究分离的1株副乳房链球菌对小鼠有较强的致病性，在抗生素用药方面也表现出一定的耐药性，并且其溶血情况发生了变化。结合国外的流行现状，该菌应当引起国内的广泛关注以及重视，应加强对于该菌的防治和管控，重视临床诊断与治疗。本研究通过对副乳房链球菌进行分离鉴定，也为该菌的防治和管控的相关研究提供了材料，并为临床诊断和用药治疗提供了科学依据。对于该菌致病机制、耐药机制等各方面的研究以及相关疫苗的研发有待进一步的深入研究。

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(责任编辑卢福庄)

Isolation， identification and biological characteristics analysis ofStreptococcusparauberis

REN Mei-shen1，2， WANG Yin1，2，*， YANG Ze-xiao1， YAO Xue-ping1， WU Xu-long1，2， XIAO Lu1，2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China)

Abstract:One strain of Streptococcus parauberis was isolated from a large scale pig farm in Sichuan Province. In this study， gram staining， culture characteristics， biochemical tests， antibiotic sensitivity tests， and 16S rRNA gene sequence analysis were used to identify the strain characteristics and resistance to drugs. The results of the 16S rRNA sequencing of the isolated strain showed 99% homology with Streptococcus parauberis. The colonies of the isolated strain on TSA agar appeared to be smooth， circular and translucent and had β-hemolysis on blood agar. The LD50of isolated strain to mice was 2.06×107 cfu per mouse. The antibiotic sensitivity experiment showed that it was sensitive to cephalosporin antibiotics but insensitive to quinolone， tetracycline and aminoglycoside antibiotics. This study laid a foundation in clinical diagnosis， disease prevention and drug treatment for associate streptococcus disease.

Key words:Streptococcus parauberis; swine; 16S rRNA; isolation and identification

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.08

收稿日期：2015-10-07

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目(2013BAD12B04)

作者简介：任梅渗(1991—)，男，重庆人，硕士研究生，从事动物传染病病原分子生物学研究。E-mail： edisonplb@126.com

*通信作者，王印， E-mail：yaanwangyin@tom.com

中图分类号：S852.61+1

文献标志码：A

文章编号：1004-1524(2016)05-0758-05

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 758-762

http://www.zjnyxb.cn

任梅渗，王印，杨泽晓，等. 一株副乳房链球菌的分离鉴定及生物学分析[J].浙江农业学报，2016，28(5): 758-762.