不同砧木对黄果柑光合特性、光合作用关键酶及其基因表达的影响

廖　玲，曹淑燕，荣　毅，古咸杰，李清南，叶　霜，邱　霞，汪志辉，2，*

(1.四川农业大学 园艺学院，四川 成都611130； 2.四川农业大学 果蔬研究所，四川 成都611130)

不同砧木对黄果柑光合特性、光合作用关键酶及其基因表达的影响

廖玲1，曹淑燕1，荣毅1，古咸杰1，李清南1，叶霜1，邱霞1，汪志辉1，2，*

(1.四川农业大学 园艺学院，四川 成都611130； 2.四川农业大学 果蔬研究所，四川 成都611130)

摘要：为了从光合生理方面了解砧木对黄果柑的影响，以枳壳、红橘和香橙为砧木，黄果柑实生苗为对照，在果实成熟期测定其净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)等日变化参数和光合响应曲线，以及核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)含量、Rubisco活化酶(RCA)含量以及 Rubisco基因 (rbcS和rbcL)及其活化酶基因 (rca)表达的影响。结果表明：不同砧木嫁接的黄果柑叶片净光合速率日变化曲线均呈双峰型，存在光合午休，3种嫁接树的净光合速率均大于实生苗；其蒸腾速率的日变化均呈单峰型，水分利用效率的日变化均为双峰型。此外，香橙嫁接的黄果柑叶片有较高的净光合速率、Rubisco含量和RCA含量及较强的rbc和rca基因表达。综合比较分析，香橙砧适宜作为黄果柑的砧木进行推广。

关键词：黄果柑；光合特性；Rubisco；RCA；基因表达

黄果柑属于芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)，原产于四川省石棉县，是四川农业大学和石棉县农业局共同选育的一种杂柑新品种。黄果柑果实晚熟耐储、肉质脆嫩多汁、酸甜可口，在川、滇一带深受群众喜爱[1]。砧木是嫁接果树的基础，对接穗品种的生长发育及果实的产量和品质等均有重要影响。我国柑橘砧木资源丰富，但长期以来以枳和红橘为主要砧木。近年来，石棉县引进香橙作为黄果柑的砧木。目前，石棉县黄果柑嫁接的砧木品种主要有枳壳[Poncirustrifoliate(L.) Raf]、红橘(CitrusreticulataBlanco)和香橙[C.junos(Sieb.) Tanaka]。有关3种砧木对石棉县黄果柑叶片的光合特性及光合作用关键酶等方面的研究还未见报道。

光合作用是制约植物生长发育的最重要的生理过程，同时又是一个对环境条件变化很敏感的生理过程[2]。光合作用是植物干物质积累和产量的基础，植物的生长以及产量与其光合作用密切相关[3]。研究植物光合作用的日变化规律，不仅可以掌握植物与环境因子之间的关系，而且可为栽培、育种提供理论依据[4]。核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose 1，5-biphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco) (EC4.1.1.39)是光合作用中固定CO2的关键酶， 由8个大亚基和8个小亚基组成，含量非常丰富，在光合叶片中，占叶片可溶性蛋白的65%。Rubisco活化酶(Rubisco activase，Rca)是核基因编码的可溶性叶绿体酶，类似Rubisco的分子伴侣，在碳同化反应中从稳定的核酮糖1，5-二磷酸(ribulose 1，5-biphosphate，RuBP)分离活化Rubisco。Rubisco和Rca的活性及基因表达对于植物的光合作用非常重要[5]，光合效率的降低是由于Rubisco大亚基(rbcL)和小亚基基因 (rbcS)，以及rca基因(rca1和rca2)表达量的减少所致[6]。

本文研究了不同砧木嫁接对黄果柑在果实成熟期光合特性、Rubisco活性和RCA活性以及Rubisco基因(rbc)及其活化酶基因(rca)表达的影响，以期揭示砧木对黄果柑叶片光合特性和光合作用相关酶的影响，最终为研究出适宜黄果柑栽培的砧木以及黄果柑生产最关键时期相应的栽培技术提供理论依据。

1材料与方法

1.1研究区自然状况

试验园地位于四川省石棉县黄果柑栽培标准示范园，该地年均气温为17.1 ℃，年积温平均5 468 ℃，1月平均气温8 ℃，极端低温4.1 ℃，极端高温38.1 ℃，平均无霜期326 d。年日照时数1 242.9 h，常年总辐射375.79 kJ·cm-2，生理辐射195.41 kJ·cm-2。年降水量平均778.3 mm，属中亚热带干热河谷气候类型。

1.2试验材料

以枳壳、红橘和香橙3种砧木嫁接的黄果柑 (以下简称为枳砧、红橘砧和香橙砧)为试材。黄果柑实生苗为对照。选择生长良好、长势基本一致的健康植株，每种砧木各3株，每株选择南向中等大小、颜色正常的叶片(顶端第5～8片叶)3片，采用美国LI-COR公司生产的LI-6400便携式光合测定系统进行叶片瞬时光合速率测定。

1.3测定方法

1.3.1光合速率日变化测定[7]

光合速率日变化于2015 年3 月中旬的晴天进行，测定黄果柑光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)等。测定前先测自然光照强度，然后将红蓝光源设定为与自然光相同的光强进行测定，当系统稳定后进行记录，每棵树各选取3片相似的功能叶进行测定，3株树共测9片叶，每片叶记录5次，记录每叶重复测定的平均值，分别为Pn，Gs，Ci和Tr等的日变化。

1.3.2光响应曲线的测定[8]

光响应曲线于2015 年3月中旬的晴天进行，每种砧木测定3株树，每株测3片叶。分别记录每叶重复测定3 次的平均值，选取所测曲线中的代表性曲线进行数据分析。测定时间为8∶30—10∶30，天气晴朗，利用LI-6400 自动light-curve 曲线测定功能，将红蓝光源设定一系列光合光通量密度，考虑到植物对弱光到强光的不敏感性，其梯度设定为：2 000，1 800，1 600，1 400，1 200，1 000，800，600，400，200，100，50 μmol·m-2·s-1。其测量参数包括：净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)，胞间CO2浓度(Ci)、光合有效辐射(PAR)等生理生态因子。水分利用效率(WUE)是光合速率与蒸腾速率的比值，即WUE=Pn/Tr，跟Pn成正比，与Tr成反比[14-15]。

1.3.3Rubisco含量与RCA含量[9]

剪下每种砧木已经测定Pn的叶片，立即置于液氮中，带回实验室。分别采用植物活化酶ELISA试剂盒(TaKaRa，日本)和植物核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶ELISA试剂盒(TaKaRa，日本)，根据说明书进行操作，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，样品的Rubisco含量与RCA含量均重复测定3次，取平均值。通过标准曲线计算样品RCA和Rubisco活性。

1.3.4实时荧光定量基因表达分析

采用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取RNA，用 TaKaRa公司的RNA PCR Kit (AMV)ver. 3.0试剂盒进行RT-PCR，操作按说明。 内参为actin(GenBank登录号GQ389668.1)。rbcS(GenBank登录号KP729051，片段大小167 bp)，rbcL(GenBank登录号KP729051，片段大小285 bp)和rca(GenBank登录号KP729049，片段大小255 bp)引物序列如下：rbcS，5′-AGTTGGAGAAAGGATGGGTGTA-3′(上游)，5′-TCGGACGAATGAATGTGGGTAT-3′(下游)；rbcL，5′-CCAAGGTAGTATTTGCGGTGAA-3′ (上游)，5′-GTAGGGCGGTTTATGAATGTCT-3′(下游)；rca，5′-CCAAGGTCTCCGCACATACAA-3′(上游)，5′-TCTCCAGCATTGCCACTTTCC-3′(下游)。每个基因重复测定3次，取平均值。

1.4数据分析

用 Microsoft Excel 2007 软件对数据进行处理和作图，SPSS 17.0 和 SAS 9.0 软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1光合速率日变化

Pn直接反映植物的光合能力的大小[10]。由图1可知：嫁接树与实生苗的Pn日变化均呈现双峰曲线，不同砧木其峰值大小不同，枳壳砧最高(5.92 μmol·m-2·s-1)，实生苗最低(2.53 μmol· m-2· s-1)。两峰低谷最小值在12∶00，即黄果柑“午休”现象较明显，3种砧木的黄果柑相比较，红橘砧的黄果柑全天均表现出较低的Pn。

2.2光合作用的光响应曲线比较

黄果柑的Pn与有效光辐射(PAR)梯度的响应如图3所示，3种嫁接树及实生苗的Pn随着PAR的增强而增大，上升趋势基本相同，由此形成4条相似的曲线。当 PAR处于50～60 μmol·m-2·s-1时，Pn随着PAR的增强而增大的趋势比较缓慢，3种嫁接树及实生苗的Pn出现最小值；而当PAR处于1 000～1 800 μmol·m-2·s-1时，Pn随着PAR的增强而增大的趋势比较急剧，且在这个阶段达到最大值，并以香橙砧的值最大；当 PAR 处于 2 000 μmol·m-2·s-1，所有黄果柑的Pn值不再增加，甚至下降。

图1　不同砧木对黄果柑Pn日变化的影响及环境因子日变化Fig.1　Effect of different rootstocks on the diurnal variation of Pn and environmental factors of Huangguoan

图2　不同砧木对黄果柑光合特性的影响Fig.2　Effects of different rootstocks on photosynthetic characteristics of Huangguoan

图3　不同砧木对黄果柑Pn响应曲线的影响Fig.3　Effect of different rootstocks on Pn response curve of Huangguoan

3种嫁接树及实生苗的Gs值随着PAR的增加先降低后升高。且香橙砧的Gs值最低；3种嫁接树及实生苗的Ci值随PAR的增强而降低，下降趋势基本相同。实生苗的最低值最小，3种嫁接树及实生苗的Tr值随PAR的增强而上升，上升趋势基本相同。实生苗的值最小，随着光强的增加，植物的光合速率也增大，WUE与光合速率是正相关的，所以3种嫁接树及实生苗的WUE值随着PAR的增大而变化的趋势与Pn 值随着PAR增大而变化的趋势相似(图4)。

图4　不同砧木对黄果柑光响应曲线的影响Fig.4　Effect of different rootstocks on the light response curve of Huangguoan

2.3不同砧木对黄果柑叶片Rubisco含量及RCA含量的影响

不同砧木对黄果柑叶片Rubisco含量日变化同净光合速率日变化的变化趋势一致(图5)，与光合速率比较高峰时间短、变幅小。香橙砧、红橘砧、枳壳砧的Rubisco含量在11：00分别较实生苗提高了27%，11%和16%；RCA活性日变化同Rubisco含量的变化趋势一致，香橙砧、枳壳砧、红橘砧和实生苗的RCA日变化均呈双峰曲线。香橙砧、枳壳砧、红橘砧的RCA含量在11：00分别较实生苗提高了20.1%，12.7%和8.6%。

2.4不同砧木对黄果柑光合作用关键酶基因表达的影响

图6是不同砧木嫁接对黄果柑叶片Rubisco和rca基因表达日变化的影响，Rubisco由大亚基rbcL和小亚基rbcS编码。香橙砧、枳壳砧、红橘砧和实生苗的rbcS基因表达量高峰值出现的时间不一致，由早至晚依次为香橙砧、红橘砧、枳壳砧、实生苗；rbcL基因表达量高峰值出现的时间较rbcS延迟，峰值出现的时间早晚依次为香橙砧、实生苗、红橘砧、枳壳砧。香橙砧、枳壳砧、红橘砧和实生苗rca基因表达量高峰出现的时间不一致，由早至晚依次为枳壳砧、香橙砧、红橘砧、实生苗。

图5　不同砧木对黄果柑光合作用关键酶活性的影响Fig.5　Effects of different stocks on key enzymes activities of photosynthesis in Huangguoan

图6　不同砧木对黄果柑光合作用关键酶基因表达的影响Fig.6　Effect of different stocks on the gene expression of key enzymes in the photosynthesis of Huangguoan

3讨论

晴天条件下，3种砧木及黄果柑实生苗叶片Pn日变化都呈现双峰曲线，有明显的“午休”现象，造成黄果柑“午休”的原因可能是午间气温过高导致大气相对湿度快速下降，蒸腾速率加快，从而引起叶面水气压饱和亏缺达到全天最高，使气孔部分关闭[14]；3种砧木及黄果柑实生苗叶片Tr的日变化曲线整体上呈“单峰型”，Tr的大小在一定程度上反映了植物调节水分损失的能力及适应逆境的能力，在果实成熟期，香橙砧可较好地利用水分，维持果实留树保鲜。3种嫁接树和实生苗黄果柑对光强的生态适应范围大小为香橙砧>红橘砧>枳砧>实生苗。

Rubisco处于光合碳还原和光合碳氧化2个方向相反但又相互连锁的循环交叉点上，它对净光合速率起着决定性的影响，是光合碳同化的关键酶[15]。本研究结果表明，黄果柑叶片的Pn和Rubisco活性具有明显的光合日变化，且变化趋势一致，这与李卫芳等[16]、潘璐等[17]的研究相似，在适宜温度条件下，光合作用的强弱取决于 Rubisco 活性[18]。本研究结果显示，嫁接后提高了黄果柑叶片中Rubisco活性。Rubisco活化酶(RCA)是一种核编码的叶绿体蛋白，在 ATP 的参与下使Rubisco迅速与生理浓度的 CO2(10 μmol·L-1)、 Mg2+结合形成 ECM(Rubisco-CO2-Mg2+)三元复合物，从而达到最大的活化程度，能解除磷酸糖对Rubisco活性的抑制作用，被认为是Rubisco的分子伴侣[19]。本试验中，RCA含量与Rubisco含量的变化趋势一致，说明RCA通过调节Rubisco活性，可间接调节光合作用。Rubisco的酶活性是Rubisco和RCA相互作用的结果，两个酶基因(rbc和rca)的表达结果显示，不同砧木对它们的表达强度有影响。实生苗的rbc和rca表达量较香橙砧、红橘砧、枳壳砧低，这可能是其光合作用较低的重要原因。Cai等[20]的实验也证明rca的表达水平能影响光合作用。 因此，要得到较高的光合效率，保持Rubisco和RCA 2个酶的高水平是非常重要的。

枳砧以其使树体矮化、抗寒等优点成为我国广为应用的优良砧木；红橘砧是我国应用较广泛的另一种柑橘砧木；资阳香橙砧的柑橘比枳砧抗碱性强、丰产性好、梢齐化；比红橘砧和本砧早结、丰产、矮化、无叶片黄化；根系茂盛，分布广，须根群多，枝势开张，果实品质好；抗逆性较强，是碱性土壤中的优良砧木[21]。本试验从光合特性的角度研究表明，不同砧木对黄果柑叶片光合能力有明显的影响，其中香橙砧Pn日变化、叶绿素含量方面表现为略高于或等于枳砧，香橙砧各指标表现为强于或不弱于红橘砧。综合分析显示，香橙砧和枳砧表现出较强的光合性能。与乔化砧相比较，矮化砧提高叶片栅栏组织与海绵组织的比值，增加叶片厚度、叶绿素含量和比叶重，降低叶片气孔密度，从而提高叶片光合速率而降低呼吸速率和蒸腾速率。同时矮砧具有低的主导管数，限制了水分和矿物质的运输，使呼吸强度和蒸腾强度降低，反过来增加了净光合速率，提高了水分利用效率。因此，初步分析认为，香橙砧可能是一个有希望的优良砧木资源，适宜作石棉县黄果柑的砧木，但需进一步对其进行遗传学研究。

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(责任编辑张韵)

Effects of different rootstocks on photosynthetic characteristics， activities and gene expression of key enzymes of photosynthesis in Huangguogan

LIAO Ling1， CAO Shu-yan1， RONG Yi1，GU Xian-jie1， LI Qing-nan1， YE Shuang1， QIU Xia1， WANG Zhi-hui1，2，*

(1.CollegeofHorticulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.InstituteofPomologyandOlericulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Abstract:In order to understand the effects of rootstocks on photosynthetic physiology of Huangguogan， trifoliate orange， red tangerine and orange were used as rootstocks，Huangguogan seedling tree was set as the control， the daily variation of parameters and photosynthetic response curves of net photosynthetic rate (Pn)， transpiration rate (Tr)， intercellular CO2 concentration (Ci) and stomatal conductance (Gs)， contant of ribulose 1，5-biphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) and Rubisco activase， and the expression of rbcS， rbcL and rca genes were determined and compared in fruit mature period. The results showed that the net photosynthetic rate curve showed a double peak type with a photosynthetic noon break， net photosynthetic rate of three kinds of grafted trees were higher than the seedling trees; the diurnal variation of transpiration rate showed a single peak type， and the diurnal changes of water use efficiency were double peak type. In addition， the leaves with orange rootstock showed higher carboxylase activity of Rubisco and net photosynthetic rate and higher expression levels of rbc and rca genes than those others. Comprehensive comparative analysis showed that the orange rootstock was suitable as rootstock for Huangguogan.

Key words:Huangguogan; photosynthetic characteristics; Rubisco; RCA; gene expression

DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2016.05.10

收稿日期：2015-08-05

基金项目：四川省科技支撑计划项目(2011NZ0034)；四川省科技厅基金项目(10ZC1454)；四川农业大学研究生社会实践与科技服务团项目(ACT201304)

作者简介：廖玲(1991—),女,四川仪龙人，硕士研究生,从事果树栽培技术与生理研究。E-mail: liao19910331@163.com

*通信作者，汪志辉，E-mail: wangzhihui_siau@126.com

中图分类号：S666

文献标志码：A

文章编号：1004-1524(2016)05-0769-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(5): 769-775

http://www.zjnyxb.cn

廖玲，曹淑燕，荣毅，等. 不同砧木对黄果柑光合特性、光合作用关键酶及其基因表达的影响[J].浙江农业学报，2016，28(5)： 769-775.