猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及荚膜血清分型

林星宇，胡　凌，王　印，*，杨泽晓，姚学萍，肖　璐，任梅渗，曾相杰

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)



猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及荚膜血清分型

林星宇1，2，胡凌1，王印1，2，*，杨泽晓1，姚学萍1，肖璐1，任梅渗1，曾相杰1

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

为了解各血清型的多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)在四川、重庆、云南的流行情况，对2013—2014年间四川、重庆、云南等地8个规模化养殖场的125份病死猪肺炎样品进行细菌分离，并用PCR方法对分离的多杀性巴氏杆菌进行鉴定及荚膜血清分型。结果表明：从有肺炎症状病死猪的肺脏样品中共分离出11株多杀性巴氏杆菌，其中有7株为A血清型(63.6%)，3株为D血清型(27.3%)，1株为F血清型(9.1%)，没有发现B和E血清型。表明在该区域内，猪肺疫主要是由A型Pm感染引起。另外，此次还分离出了1株较少见的F型多杀性巴氏杆菌。该结果可为上述地区巴氏杆菌病的防治提供科学材料。

猪；多杀性巴氏杆菌；聚合酶链式反应(PCR)；血清分型

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)是引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体，主要引起动物出血性败血症或传染性肺炎。该菌广泛分布于世界各地，在同种或不同动物间可相互传染，也可感染人[1]。猪巴氏杆菌病又称猪肺疫或猪出血性败血症，是猪的一种急性、热性传染病，给世界养猪业造成极大的经济损失，严重威胁现代养猪业的健康发展，我国将其划分为二类动物疫病[2]。有研究报道多杀性巴氏杆菌的荚膜具有保护细菌的功能，可以抵抗吞噬细胞的吞噬及中和抗体，对宿主具有侵袭力，从而被视为多杀性巴氏杆菌重要的毒力因子[3]。Carter等[4]根据荚膜抗原的不同将多杀性巴氏杆菌分为A，B，D，E和F等5个血清型。以往，在我国主要流行的猪源多杀性巴氏杆菌为A，B和D型，没有E型和F型的报道[5-7]。由于巴氏杆菌的荚膜血清型决定其免疫原性，而各血清型之间交叉免疫保护性较低，导致疫苗免疫效果不理想[8]，因此疫苗的研发需要以多杀性巴氏杆菌的流行情况为依据。本研究从四川及周边重庆、云南等地8个规模化养猪场采集病死猪肺脏样本，对猪源多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定及荚膜血清分型，以期为巴氏杆菌病的防治提供科学材料。

1　材料与方法

1.1样品来源

125份样本来自四川省(103份)及其周边重庆(15份)、云南(7份)的8个规模化养殖场送检的表现有疑似呼吸系统疾病症状的病死猪肺组织样品。

1.2主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、麦康凯琼脂培养基，抗菌药物药敏纸片及微量生化反应管购自杭州微生物试剂有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA分子量标准DL2000、DNA纯化回收试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司；T-Vector pMD19(Simple)载体购自宝生物工程(大连)有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3Pm的分离及初步鉴定

无菌采取疑似多杀性巴氏杆菌病料肺脏组织，画线接种于胰蛋白大豆琼脂(tryptic soy agar， TSA)平板，37 ℃培养24 h后观察，对在平板上长有灰白色、光滑、湿润的菌落进行革兰氏及瑞氏染色。革兰氏染色呈阴性细小杆菌，瑞氏染色呈两极浓染的细菌为可疑菌落，将可疑菌株纯化后接种于麦康凯琼脂平板，并采用微量生化反应管对其做生化鉴定。

1.4PCR鉴定

PCR引物参考Townsend等[9]鉴定Pm种的特异性基因Kmt，设计引物Kmt-1，Kmt-2对疑似为Pm的菌落进行PCR鉴定。Kmt-1：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′；Kmt-2： 5′-CTGTAAACGAACTCGCCACTT-3′，预期扩增片段大小为456 bp，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.4.1PCR模板

用接种环挑取单菌落，悬浮于含50 μL无菌双蒸水的离心管中，100 ℃水浴5～10 min后，迅速置于冰上冷却5 min，12 000g离心3 min，上清即为PCR模板。

1.4.2PCR反应体系

2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·μL-1)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，加双蒸水补足25 μL。

1.4.3PCR反应条件

PCR反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物4 ℃短暂保存。

1.4.4PCR结果观察

PCR扩增产物经10 g·L-1琼脂糖凝胶进行电泳，并于凝胶成像系统下观察结果。

1.4.5PCR产物的克隆及鉴定

任意挑选一株PCR阳性产物回收，连接到pMD19-T载体，转化至大肠埃希菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞，挑取单菌落，摇床培养，将鉴定阳性的质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.5PCR分型

参考Townsend等[9]关于A，B，D，E，F荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC，bcbD，dcbF，ecbJ，fcbD设计引物Pm A，Pm B，Pm D，Pm E，Pm F。引物由上海英骏生物技术有限公司合成(表1)。

表1不同引物的核苷酸序列

Table 1Nucleotide sequences of primers

引物引物序列(5’—3’)扩增片段大小/bpPmA1TGCCAAAATCGCAGTCAG1044PmA2TTGCCATCATTGTCAGTGPmB1CATTTATCCAAGCTCCACC760PmB2GCCCGAGAGTTTCAATCCPmD1TTACAAAAGAAAGACTAG-GAGCCCC657PmD2CATCTACCCACTCAACCATAT-CAGPmE1TCCGCAGAAAATTATTGACTC511PmE2GCTTGCTGCTTGATTTTGTCPmF1AATCGGAGAACGCAGAAATCAG852PmF2TTCCGCCGTCAATTACTCTG

用接种环挑取单菌落，悬浮于含50 μL无菌ddH2O的离心管中，100 ℃水浴5～10 min后，迅速置于冰上冷却5 min，12 000g离心3 min，上清即为PCR模板。荚膜血清分型采用多重PCR，反应体系(25 μL)为2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，加ddH2O补足25 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s， 55 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，30个循环； 72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经10 g·L-1琼脂糖凝胶进行电泳，并于凝胶成像系统下观察结果。

2　结果与分析

2.1Pm的初步鉴定

凡是在麦康凯琼脂平板上不生长，能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖，不能发酵乳糖、阿拉伯糖、吲哚，硝酸盐还原试验阳性，甲基红、石蕊、枸橼酸盐利用试验阴性者，初步鉴定为多杀性巴氏杆菌。结果显示：从125份肺脏样品中共分离出11株多杀性巴氏杆菌，分离率为8.8%。

2.2PCR鉴定

以细菌基因组DNA为模板，采用鉴定引物Kmt进行PCR扩增，结果显示在250～500 bp之间有一特异性片段，与预期的长度456 bp相符(图1)。

2.3PCR分型结果

以细菌基因组DNA为模板，经多重PCR进行荚膜血清分型，结果显示，有1株为F血清型，占9.1%；7株为A血清型，占63.6%；3株为D血清型，占27.3%(图2)；本试验没有发现B和E血清型菌株。

M: DNA分子量质量标准；1-11： 分离菌株；12： 阴性对照。图1　分离菌株PCR种属鉴定Fig.1　PCR identification of the isolated strains

M: DNA分子量质量标准；1: F型多杀性巴氏杆菌；2-8: A型多杀性巴氏杆菌；9-11: D型多杀性巴氏杆菌；12：阴性对照。图2　分离菌株PCR分型Fig.2　PCR typing of the isolated strains

2.4基因克隆的测序分析

将F型巴氏杆菌的PCR阳性产物回收，连接到pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α，将鉴定阳性的质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。克隆的Kmt基因片段测序结果表明，其全长为456 bp。Blast结果显示其与GenBank中的多杀性巴氏杆菌特异性基因Kmt核酸序列(登录号为CP004392.1)同源性为99.3%(GenBank中的登录号为KP222299)。对克隆的fcbD基因片段测序结果表明，它与F型特异性基因fcbD序列(登录号为AY604234.1)的同源性为99.9%(GenBank中的登录号为KP205386)。基因序列比对结果显示其在第577位有1个碱基发生突变，由A→G(图3)。

3　讨论

多杀性巴氏杆菌广泛存在于正常猪的上呼吸道、扁桃体等器官和组织中，因而猪群多杀性巴氏杆菌的带菌率与猪群是否发生猪巴氏杆菌病并无直接关系[10]。一般认为动物在发病前已经带菌，当各种诱因使畜禽机体抵抗力降低时，病原菌即可乘虚侵入体内，经淋巴液而入血流，发生内源性感染[2]。因此，本研究以发病猪的肺脏为主要病料，这在一定程度上代表了导致猪发生巴氏杆菌病的病原情况。本研究对四川及周边省份送检的125份肺组织样本进行细菌的分离鉴定，并采用了Townsend等[9]建立的PCR方法对多杀性巴氏杆菌进行鉴定及荚膜血清分型，该PCR方法是一种快速、可靠和准确的鉴定多杀性巴氏杆菌及荚膜血清的方法，且已得到国内外学者的认同，可以保证分离的准确性。

图3　同源性比对结果Fig.3　Result of homology alignment

多杀性巴氏杆菌是猪的一种主要细菌性病原之一， 该菌各血清型菌株的流行性存在较大差异， 具有明显的地方性特征。2005年唐先春等[6]报道从肺炎症状猪分离的Pm有16.7%(4/24)为A型，75%(18/24)为D型，4.2%(1/24)为B型。2003年Davies等[11]报道从肺炎症状猪分离的Pm有81%(101/125)为A型，16%(20/125)为D型，1%(2/125)为F型。2011年Garcia等[12]报道从肺炎症状猪分离的Pm有83.5%(122/146)为A型，15.7%(23/146)为D型，0.7%(1/146)为F型。本研究在2013—2014年从四川及周边地区125份肺炎病料中，共分离出11株多杀性巴氏杆菌，其中7株为A血清型(63.6%)，3株为D血清型(27.3%)，1株为F血清型(9.1%)，没有发现B和E血清型。结果表明，在该区域引起肺炎症状的Pm主要由A型Pm感染引起。值得一提的是，以往国内畜禽流行的多杀性巴氏杆菌荚膜血清型主要是A，B和D型，而本研究分离鉴定了1株极少见的猪源F型多杀性巴氏杆菌。关于该F型巴氏杆菌分离株导致仔猪发病死亡的原因，有以下3种可能：第1种可能是这批仔猪未接种疫苗。因为有研究表明荚膜血清A型与荚膜血清F型有紧密的联系，推测其可能有相似的外膜蛋白，导致这两个血清型之间有一定程度上的交叉免疫保护作用[9]，因此以往接种了A型巴氏杆菌疫苗的仔猪产生的抗体，可能在抵御A型巴氏杆菌感染同时，也抵御了一些F型巴氏杆菌的感染。因而很少有F型巴氏杆菌引起仔猪发病病例的报道。第2种可能是由于基因突变引起该菌株毒力的改变，我们对这株F型巴氏杆菌fcbD基因的测序分析，显示其在第577位有1个碱基发生突变，由A→G，氨基酸序列由H→R。第3种可能是F型巴氏杆菌是由其他动物宿主传染给仔猪，并导致其发病的[13]。至于该F型多杀性巴氏杆菌引起仔猪发病的具体原因，还需进一步研究。

目前，疫苗免疫仍是控制巴氏杆菌病的最重要措施之一，且已有多种多杀性巴氏杆菌疫苗商品化。由于荚膜血清型决定多杀性巴氏杆菌的免疫原性，而各血清型之间交叉免疫保护性较低，因此疫苗免疫后取得的预防效果并不理想[8]。本研究通过常规方法对猪源多杀性巴氏杆菌进行了分离鉴定和荚膜血清分型，为猪巴氏杆菌病防治及相关研究提供了科学材料。

[1]王红旗，魏燕玲. 多杀性巴斯德氏菌与人类感染[J]. 中国人兽共患病杂志，1993，9(1)：54-55.

[2]陈溥言. 兽医传染病学[M]. 5版. 北京：中国农业出版社，2006.

[3]李浩，刘阳，李长安，等. 多杀性巴氏杆菌研究进展[J]. 畜牧兽医杂志，2011，30(2)：31-33.

[4]CARTER G R， CHENGAPPA M M. Recommendations for a standard system of designating serotypes ofPasteurellamultocida[J].Proceedingsofthe24thAmericanAssociationofVeterinaryLaboratoryDiagnosticians， 1981， 24: 37-42.

[5]陆承平. 兽医微生物学[M]. 4版. 北京：中国农业出版社，2007: 136-137.

[6]唐先春，吴斌，索绪峰，等. 猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]. 畜牧兽医学报，2005，36(6)：590-595.

[7]李永明，罗阿东，徐景峨，等. 猪源多杀性巴氏杆菌的生物学鉴定与荚膜PCR分型[J]. 中国预防兽医学报，2007，29(7)：506-509.

[8]杨泽晓，周香，王印，等. 肉鹅巴氏杆菌的诊治[J]. 动物医学进展，2013，34(1)：119-122.

[9]TOWNSEND K M， BOYCE J D， CHUNG J Y， et al. Genetic organization ofPasteurellamultocidacap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J].JournalofClinicalMicrobiology， 2001， 39 (3): 924-929.

[10]席晓剑，赵战勤，薛云，等. 猪源多杀性巴氏杆菌的病原流行病学及其毒力特性[J]. 中国兽医学报，2015，35(8)： 1205-1209.

[11]DAVIES R L， ROSLYN M C， SUSAN B， et al. Characterization and comparison ofPasteurellamultocidastrains associated with porcine pneumonia and atrophic rhinitis[J].JournalofMedicalMicrobiology， 2003， 52(1): 59-67.

[12]GARCIA N， FERNANDEZ-GARAYZABAL J F， GOYACHE J， et al. Associations between biovarand virulence factor genes inPasteurellamultocidaisolates from pigs in Spain[J].VeterinaryRecord， 2011， 169(14)：362-366.

[13]JAGLIC， ZORAN， JEKLOVA. Host response in rabbits to infection withPasteurellamultocidaserogroup F strains originating from foul cholera[J].CanadianJournalofVeterinaryResearch， 2011， 75(3)：200-208.

(责任编辑卢福庄)

Isolation， identification and capsule serotyping of Pasteurella multocida originated from swine

LIN Xing-yu1，2， HU Ling1， WANG Yin1，2，*， YANG Ze-xiao1， YAO Xue-ping1， XIAO-Lu1， REN Mei-shen1， ZENG Xiang-jie1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China)

To investigate the serotypes ofPasteurellamultocidain Sichuan， Chongqing and Yunnan， a total of 125 tissue samples were collected from intensive piggery during 2013 to 2014. PCR was performed to identify the isolatedPasteurellamultocidaand separate their capsular serotyping. It was shown that 11 strains ofPasteurellamultocidawere isolated from the lung tissues of swine. PCR typing assay indicated that 7 strains were serotype A (63.6%)， 3 strains were serotype D (27.3%)， 1 strain was serotype F (9.1%)， the serotype B and serotype E were not found. It suggested that swine lung plague was mainly caused by serotype APasteurellamultocidain these areas. In addition， a rare serotype F was isolated from the collected swine lung tissues. These results would provide scientific basis for the prevention and treatment ofPasteurellamultocida in above areas.

swine;Pasteurellamultocida; PCR; serotyping

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.03

2015-09-22

“十二五”国家科技支撑计划项目(2013BAD12B04)

林星宇(1990—)，男，四川自贡人，硕士研究生，研究方向为动物传染病病原分子生物学。E-mail：yaanlinxingyu@163.com

，王印，E-mail：yaanwangyin@tom.com

S855.1

A

1004-1524(2016)04-0558-05

林星宇，胡凌，王印，等. 猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及荚膜血清分型[J].浙江农业学报，2016，28(4): 558-562.