响应面法优化纤维素酶对麦芽-麦胚芽发酵酒的澄清效果

王 凯，黄 钰，程 浩，武纪天，李 楠

(广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530004)

麦芽别称穬麦蘖（《名医别录》），《名医别录》“麦穬”条云：“作蘖，温，消食和中。”用适量水浸泡麦粒，使其处于适宜的湿度和温度，幼芽长到约0.5 cm，干燥即可制得麦芽。麦芽味道甘甜，其性偏暖，具有润气消食、健脾归中等功效，长期服用可对脾虚食少者身体恢复产生良好效果[1-2]。

小麦胚芽是面粉加工的副产品，大多数在生产过程中废弃，得不到有效利用。小麦胚芽可用作饲料，其含有多种营养素(如优质蛋白、脂肪、维生素、矿物质等)，还有多种生理活性物质(如麦胚凝集素、谷胱甘肽、黄酮类物质、二十八烷醇等)[3]。目前研究表明，小麦胚芽已被较多用于食品方面的研究，例如生产饮料[4]、制作新品纳豆[5]、保护熟鱼片油稳定性[6]等。

纤维素酶由于可以分解纤维素，在生物医药、食品研发、造纸行业等领域中受到广泛使用。程浩等[7]以桂林月柿为原料发酵酿造柿子醋,在澄清过程中添加纤维素酶，澄清效果良好。陈智理等[8]通过单因素和正交试验,对纤维素酶和果胶酶酶解处理香蕉果酒的得率和澄清度进行试验，在最优条件组合下酶解后香蕉果酒的得率和透光率的综合评价指标为91.1%。BARBOSA K L等[9]分离、筛选和部分鉴定甘蔗螟虫肠道中存在的细菌纤维素酶，以期将纤维素酶作为一种医用抑制剂。目前关于纤维素酶对于麦芽-麦胚芽酒的澄清研究尚未报道，本试验以萌发麦芽以及小麦胚芽为原料酿造麦芽-麦胚芽酒，加入纤维素酶进行澄清，在单因素实验基础上，以澄清时间、澄清温度、纤维素酶添加量为自变量，透光率为响应值，通过响应面法优化麦芽-麦胚芽酒澄清工艺，以获得澄清的发酵酒，为麦芽和小麦胚芽应用于工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

麦芽与麦胚芽，市售；麦芽-麦胚芽酒，本实验室发酵自制；酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司；纤维素酶，南宁庞博生物工程有限公司。

仪器与设备：恒温水浴锅，重庆雅马拓科技有限公司；SN510C 全自动高压灭菌锅，重庆雅玛拓科技有限公司；SHP-250 生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；JJ-2 组织捣碎机，常州迅生仪器有限公司；YP201N电子天平，上海菁华科技仪器有限公司；PL-303 分析天平，METTLER TOLEDO 有限公司；UVmini-1240 紫外-可见分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 麦芽-麦胚芽酒的酿造工艺

麦芽精选→组织捣碎机粉碎→加入麦胚芽（麦芽与麦胚芽质量比2.5∶1）→加水混匀（料液体积比1∶3）→65 ℃糖化→取上清液→高温灭菌→接种→28 ℃发酵7 d（酵母活化）→酒渣分离→澄清过滤→原酒→杀菌灌装→成品

1.2.2 单因素澄清实验

澄清时间对澄清效果的影响：将纤维素酶按照400 mg/L 质量浓度加入到麦芽-麦胚芽发酵酒中，充分摇匀，45 ℃水浴条件下分别澄清0、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h 后取出，室温静置2 d 后离心取上清液在波长750 nm下测定透光率[10]。

澄清温度对澄清效果的影响：将纤维素酶按照400 mg/L 质量浓度加入到麦芽-麦胚芽发酵酒中，充分摇匀，分别设置温度为30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃的水浴条件，澄清6 h 后取出，室温静置2 d后按上述方法测定透光率。

纤维素酶添加量对澄清效果的影响：将纤维素酶按照0、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L 质量浓度加入到麦芽-麦胚芽发酵酒中，充分摇匀，45 ℃水浴条件下澄清6 h 后取出，室温静置2 d后按上述方法测定透光率。

1.2.3 响应面试验设计优化澄清工艺

根据单因素实验所得数据，采用响应面方法优化澄清工艺，以澄清时间（A）、澄清温度（B）、纤维素酶添加量（C）3个因素为自变量，以透光率（Y）为响应值，根据Box-Benhnken 试验设计原理，设计3因素3 水平试验进行优化，进行响应面分析，并验证结果的可靠程度。响应面因素与水平见表1。

表1 澄清工艺优化Box-Benhnken试验设计因素与水平

1.2.4 数据处理与分析

单因素实验过程中取3 次平行进行测定，所得数据通过Origin2017 版绘图软件进行展示。响应面法采用Design-Expert V8.0.6软件进行设计，并进行数据分析。采用SPSS21.0 统计软件进行方差分析和显著性检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 发酵酒澄清工艺优化单因素实验

2.1.1 澄清时间对澄清效果的影响（图1）

图1 时间与澄清效果的关系

由图1 可知，发酵酒的透光率随着澄清时间的延长先增高后下降，在0～6 h澄清时间范围内逐渐增大，在6～15 h 澄清时间范围内逐渐下降。出现先增大后下降的原因是由于澄清时间过短，酶作用时间不够充裕，在较短的时间内不能澄清酒体中的纤维素类物质；若澄清时间过长，已经絮凝的物质会重新溶解到体系中，导致透光率的下降。透光率在澄清时间为6 h 时达到最大，可达87.4%，因此采用澄清时间为6 h进行澄清。

2.1.2 澄清温度对澄清效果的影响（图2）

图2 温度与澄清效果的关系

由图2 可知，随着温度的升高，透光率呈现出先增大后下降的趋势，在30～45 ℃澄清温度范围内逐渐增大，在45～55 ℃澄清温度范围内逐渐下降。导致透光率呈现上述变化趋势的原因是，在较低温度条件下，酶达不到比较适宜的温度，其澄清效果欠佳，对于酒体中大分子物质澄清不彻底；在较高温度条件下，由于温度较高，超过了酶作用的最适温度，酶活下降，并且较高的温度酒体分子热运动也更为明显，从而导致酒体透光率下降。透光率在澄清温度为45 ℃时达到最大，可达87.8%，因此采用澄清温度为45 ℃进行澄清。

2.1.3 纤维素酶添加量对澄清效果的影响（图3）

图3 纤维素酶添加量与澄清效果的关系

由图3 可知，随着纤维素酶添加量的逐渐增多，透光率的变化趋势为先增大后下降。在0～400 mg/L 纤维素酶添加量范围内，透光率随着添加量的增多而增大，在400～700 mg/L 纤维素酶添加量范围内，透光率随着添加量的增多而下降。造成这种现象产生的原因是，在酶添加量较低的范围内，酶的总量能使酒体达到较好的澄清效果；当酶添加量达到较高范围时，过量的澄清剂使得酒体中更易产生二次浑浊，从而影响稳定性，进而导致酒体透光率的下降。透光率在纤维素酶添加量为400 mg/L 时达到最大，可达88.7 %，因此采用纤维素酶添加量400 mg/L进行澄清。

2.2 发酵酒澄清工艺响应面优化

2.2.1 响应面模型的建立及分析

在单因素实验所得数据的基础上，进行Box-Benhnken 试验设计，以澄清时间（A）、澄清温度（B）、纤维素酶添加量（C）3 个因素为自变量，以透光率（Y）为响应值，应用Design-Expert V8.0.6 软件对试验所得数据进行回归拟合及分析。响应面优化试验方案及结果见表2，模型分析见表3。

利用软件对试验数据进行回归拟合，所得自变量与透光率（Y）的二次多项回归方程如下：

由表3可知，模型P值=0.0001＜0.01，达到极显著水平，说明响应面试验所得模型可靠，拟合性良好，可用于后续优化；失拟项P 值=0.2955＞0.05，显著水平为不显著，表明方程拟合良好，未出现失拟现象，试验方法可靠性高；因素A、C 的P 值均小于0.01，说明澄清时间与纤维素酶添加量对麦芽-麦胚芽酒的澄清效果影响是极显著的，而因素B 的P值=0.0151＜0.05，表明澄清温度对麦芽-麦胚芽酒澄清效果影响是显著的；交互项AB 的P 值=0.0145＜0.05，说明此交互项AB对酒体澄清效果具有显著影响，而交互项AC、BC 的P 值均大于0.05，说明交互项AC、BC 对酒体澄清未达到显著影响；A2、B2、C2均小于0.01，表明A2、B2、C2对酒体澄清效果影响极显著。由F 值可知因素C＞A＞B，表明所选取的3 个因素对酒体澄清效果的影响顺序为：纤维素酶添加量＞澄清时间＞澄清温度。

表2 响应面试验设计与结果

表3 回归模型方差分析结果

表4 方差相关系数

由表4 可知，拟合度R2=0.9727，校正拟合度R2Adj=0.9376，两者数值较接近，表明所建立的模型与实际试验拟合性良好，准确性高；预测拟合度R2Pred=0.7340，表明模型预测性良好；变异系数CV（%）=1.22＜5.0%，表明方程的可重现性良好[11]；信噪比=13.857＞4.0，表明试验精密度高，模型可信度高。综上所述，可利用此模型进行分析各因素变化对响应值的影响，并预测其变化规律。

2.2.2 各影响因素交互作用分析（图4）

由图4A 可知，在纤维素酶添加量一定时，随着澄清时间的延长与澄清温度的升高，透光率呈现出先增大后下降的趋势，且等高线图呈现为明显的椭圆形。两种因素在较低范围内增加时，透光率逐渐增大；当两种因素增加到较高范围时，又会导致透光率的降低。这表明交互项AB对透光率的影响是显著的。

由图4B 可知，在澄清温度一定时，随着澄清时间的延长与纤维素酶添加量的增加，透光率呈现出先增长后下降的趋势，等高线图呈现为较接近圆形，显著性不明显[12]。这表明交互项AC 对透光率的影响不显著。

由图4C 可知，在澄清时间一定时，随着澄清温度的升高与纤维素酶添加量的增加，透光率呈现出先上升后降低的趋势，等高线图虽为较明显的椭圆形，但其等高线图较疏松，表明爬坡较缓，显著性不明显。这表明交互项BC对透光率的影响不显著。

2.2.3 澄清效果验证性实验（图5）

图4 因素交互作用对麦芽-麦胚芽酒澄清度影响的响应曲面和等高线

通过Design-Expert V8.0.6 软件所得到的回归模型，预测的麦芽-麦胚芽酒澄清条件理论最佳值为：澄清时间6.75 h，澄清温度46.39 ℃，纤维素酶添加量468.62 mg/L；预测最佳透光率为90.7374%，其可行性达到0.581。按照实际条件操作的可行性进行模拟，选取实验条件为澄清时间7 h，澄清温度46.4 ℃，纤维素酶添加量470 mg/L 进行验证实验，得到实际麦芽-麦胚芽酒的透光率为90.2 %，与理论预测值90.7374 %相差较小，可以采用。综上所述，基于响应曲面法所得的优化澄清工艺参数准确可靠，得到的工艺条件具有实际操作性。

3 结论

本试验通过单因素实验选取最优条件值，利用Design-Expert V8.0.6 软件进行Box-Benhnken 试验设计，以澄清时间、澄清温度、纤维素酶添加量为自变量，麦芽-麦胚芽酒的透光率为响应值，对试验数据进行回归拟合，所得自变量与透光率（Y）的二次多项回归方程为：Y=89.22+1.74A+1.18B+3.31C-1.68AB+1.15AC+0.43BC-4.11A2-1.89B2-2.71C2，并确定麦芽-麦胚芽酒最佳澄清条件为：澄清时间7 h，澄清温度46.4 ℃，纤维素酶添加量470 mg/L，得到酒体透光率为90.2%，为纤维素酶规模化用于酒类澄清及麦芽与麦胚芽工业化应用提供参考。

图5 预测条件的可行性