玫瑰橙子果酒混菌发酵工艺优化

艾小满，唐 菁，赵兴秀，方 欢，刘程阳，张 柱，刘苑皓，李仕鲁

（四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000）

橙子果酒富含多种维生素和氨基酸，极具保健功能，具有较高的研究价值[1]。随着我国经济的不断发展，以橙子柑桔类水果为代表的水果产量和种类也在不断增加，而橙子的鲜食消费市场却相对有限，拓展销路成为了解决橙子积压问题的首要方法。为了提高酒体的色泽、增加果酒的挥发性香气成分，本试验在以玫瑰、橙子为原料的基础上增添了玫瑰茄，并加入库德毕赤酵母进行混菌发酵。通过单因素试验以果酒发酵的温度、时间、初始糖度、混菌接种比例、混菌接种量以及玫瑰和玫瑰茄的添加比例为条件变量，对果酒发酵最适条件进行探索，利用正交试验确定果酒发酵的最佳工艺参数。采用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GCMS)技术对玫瑰橙子果酒的挥发性香气进行检测。结果表明，加入了玫瑰茄和毕赤酵母后的玫瑰橙子果酒抗氧化性更强，挥发性香气更多，色泽艳红，香气醇厚，口感柔和。

1 材料与仪器

1.1 材料、试剂及仪器

原料：橙子、玫瑰、玫瑰茄、白砂糖本地市售。

菌种：拉曼德·酿酒酵母（憨酒匠自酿坊），库德毕赤酵母（实验室筛选），其他试剂均为国产色谱纯和分析纯。

仪器设备：气相色谱仪（6890N-5975B 气质联用仪），安捷伦科技(中国)有限公司；顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)；V-1000 可见分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司；SHP-80 生化培养箱，常州普天仪器制造有限公司金坛市晶玻实验仪器厂；甜度折光仪，ATC。

1.2 试验方法

1.2.1 玫瑰橙子果酒酿造工艺

原料预处理（干玫瑰花、玫瑰茄粉碎；新鲜橙子浸泡清洗，去皮榨汁）→原料混合→护色杀菌→成分调整→酵母接种→主发酵→倒酒→陈酿→脱苦澄清→巴氏消毒→玫瑰橙子果酒成品

1.2.2 单因素和正交试验

为了使混菌酿造的玫瑰橙子果酒达到较高的酒精度及较好的感官指标，先经过单因素试验考察玫瑰及玫瑰茄添加比例、发酵时间、菌株接种量、发酵初始糖度、发酵温度等因素对混菌发酵玫瑰橙子果酒品质的影响，再以pH 值、吸光度、酒精度、总酸、残糖和果酒成品的感官评分为试验指标，进行L9（33）正交试验[2]。

1.2.3 玫瑰橙子果酒产品质量测定

采取国标测定方法[3]对每天发酵过滤后果酒的pH 值、总酸、残糖、吸光度及发酵3 d、4 d、5 d 的果酒的酒精度进行测定。再将发酵所得玫瑰橙子果酒经过滤后，由10 人组成的感官评定小组对玫瑰橙子果酒的色泽、香气、口感三方面进行感官评分。评分标准见表1。

1.2.4 玫瑰橙子果酒抗氧化性研究

酚类的一般特征是结构中羟基与苯环直接相连，是极好的氢或电子供体，由于形成的酚类游离基中间体的共振非定域作用和没有适合分子氧进攻的位置，比较稳定，不会引发新的游离基或由于链反应而被迅速氧化，所以是很好的抗氧化剂[4]。本试验采取福林酚法[5]测定玫瑰橙子果酒多酚类含量。黄酮类物质是广泛存在于植物中的天然产物，具有多种生理调节功能，并可清除自由基，发挥抗氧化功能，保护细胞膜的完整性[6-7]。果汁中的黄酮含量和抗氧化活性之间有显著的相关性[8-9]。本试验采取络合比色法[10]测定玫瑰橙子果酒中黄酮类物质含量。

表1 感官评分标准

1.2.5 玫瑰橙子果酒挥发性香气成分检测方法

运用HS-SPME 法[11]萃取玫瑰橙子果酒挥发性香气成分，为了使固定相更好的附在柱子的内壁上，第一次使用时需于气相色谱进样口230 ℃，老化2 h，高温可以去除一些杂质和溶剂，看到气相上的基线平稳后进行下一步操作。取玫瑰橙子新酒6 mL 于15mL顶空瓶中，加入1.2 g NaCl 封 口，50 ℃下于磁力搅拌器上平衡20 min，插入老化2 h的萃取纤维头吸附30 min，于进样口解析3 min，然后收集数据。

色谱条件：（色谱柱：C18管柱，进样口温度250 ℃载气(He)：流量1.0 mL/min，不分流进样）程序升温:起始温度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 进样升至110 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min 进样升至150 ℃，保持2 min，最后以8 ℃/min 进样升至250 ℃，保持10 min[11]。

质谱条件:离子源温度250 ℃，离子化方式EI，电子能量70 eV，分辨率1000，质量范围为30～500 u/s[12]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 玫瑰花、玫瑰茄添加比例对玫瑰橙子果酒品质的影响

设定玫瑰花与玫瑰茄添加比例分别为4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4；果酒发酵初始糖度为24°Bx，酵母接种量为6.0 %，发酵温度为25 ℃，玫瑰和玫瑰茄与橙汁比例（质量比g/mL）为5∶100，发酵5 d，过滤，通过感官评定和理化指标检测玫瑰花、玫瑰茄添加比例对果酒风味的影响，结果见表2。

由表2 可以看出，不同玫瑰花、玫瑰茄的添加比例对玫瑰橙子酒的品质有较大影响，其中玫瑰茄的比重越大，口感越酸，酒体的颜色越深，香气越浓。发酵5 d 的5 组酒精度都达到10.9 %vol，其残糖也在8.0 °Bx 左右，除去实验仪器及发酵过程测定的误差影响，5 组所达到的酒精度以及残糖相差无几，但总酸和pH 值的测定结果却略有不同。因此玫瑰花、玫瑰茄的不同添加比例不会影响果酒的酒精度，但会影响果酒的pH 值和总酸含量。分析其原因，玫瑰茄中总酸含量高达75%，所以玫瑰茄的比重越大，果酒的pH 值越小，总酸含量越高，因此添加玫瑰茄可能只对发酵酒的香味及口感有所影响，而对酵母的新陈代谢无太大影响。对发酵所得玫瑰橙子果酒经过滤后，以10 人组的感官评定结果得知玫瑰花、玫瑰茄比为1∶1 组的感官综合评分高达80 分，其果酒色泽呈艳红色，澄清，无悬浮物；香气相对浓郁。所以，最终选取玫瑰花、玫瑰茄添加比例为1∶1。

表2 不同玫瑰花、玫瑰添加比例的果酒理化性质测定结果及综合评分

表3 不同酿酒酵母、毕赤酵母接种比例的果酒理化性质测定结果及综合评分

2.1.2 酿酒酵母、毕赤酵母接种比例对玫瑰橙子果酒品质的影响

设定酿酒酵母与毕赤酵母接种比例分别为1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1；固定其他发酵条件，发酵后过滤，通过感官评定和理化指标检测混菌接种比例对果酒风味的影响，结果见表3。

由表3 可以看出，接种毕赤酵母对果酒的色泽影响不大，但对果酒的口感和香气有一定的影响。发酵5 d 的玫瑰橙子果酒从理化性质的测定结果来看，5 组所达到的酒精度为10.5 %vol～13.9 %vol，总酸为8.75～9.27 g/L 变化，幅度较大，残糖达到一个平衡值9.0 °Bx 左右，说明毕赤酵母的比重对玫瑰橙子果酒的发酵有一定影响。再由感官评分结果可以看出，当毕赤酵母比重过大时，其果酒的口感及香气效果反而变差，分析其原因可能较多的毕赤酵母产香，少数的酿酒酵母发酵产酒精，从而导致果酒品质不佳。以10 人组的感官评定结果得知酿酒酵母、毕赤酵母的比例为1∶1 的感官综合评分高达85 分，其果酒色泽呈深红色，澄清，无悬浮物；香气浓郁，纯正协调；口感微苦，酸味适中。所以，最终选取酿酒酵母、毕赤酵母的接种比例为1∶1。

2.1.3 发酵时间对果酒的影响

以玫瑰橙子果酒发酵时间为变量，固定其他工艺条件，发酵后过滤，通过感官评定和理化指标检测发酵时间对果酒的影响，结果见表4。

由表4 可看出，不同发酵时间对玫瑰橙子果酒的酒精度以及果酒品质有显著影响，酒精度随发酵时间的延长而变化，直到发酵到第5 天后酒精度达到最高值13.8 %vol，而整体果酒的色泽、香气、口感在5～6 d 达到最佳，此外pH 值呈先下降后上升趋势，总酸呈先上升后下降趋势，最终达到9.88 g/L左右。分析其中的原因，当玫瑰橙子果酒在正常发酵情况下，随着发酵时间的延长，其糖分逐渐被消耗，酒精度升高，高酒精度对酵母菌有抑制作用，因此达到一定酒精度后便下降。以10 人组的感官评定结果得知，发酵时间5 d 组的感官综合评分高达86 分，其果酒色泽呈艳红色；果香浓郁；滋味略酸。所以，最终选取发酵时间为5 d。

2.1.4 混菌接种量对果酒的影响

设定果酒混菌接种量分别为2 %、4 %、6 %、8%和10%；固定其他工艺条件，发酵后过滤，通过感官评定和理化指标检测混菌接种量对果酒风味的影响，结果见表5。

由表5 可以看出，不同混菌接种量对玫瑰橙子果酒的酒精度以及果酒品质有一定影响，发酵5 d后的玫瑰橙子果酒酒精度和吸光度随发酵酵母接种量的增加而先升高后降低，总酸呈下降趋势，pH值无较大变化，当酵母接种量达到6 %时，其果酒品质和酒精度达到最佳状态。分析其中的原因，当玫瑰橙子果酒在正常发酵情况下，酵母接种量多的其生长繁殖所需要消耗的糖分越多且酿酒酵母和毕赤酵母在一定量下存在着某种拮抗作用导致接种量达到6 %后其酒精度下降同时果酒品质随着下降。以10 人组的感官评定结果得知，酵母接种量6%组的感官综合评分高达88 分，其果酒色泽呈艳红色，有光泽，无悬浮物；酒香浓郁优雅，香味纯正协调；口感柔和，酸甜适中。所以，最终选取混菌接种量为6%。

表4 不同发酵时间的果酒理化性质测定结果及综合评分

表5 不同酵母接种量的果酒理化性质测定结果及综合评分

2.1.5 初始发酵糖度对果酒的影响

设定玫瑰橙子果酒发酵初始糖度分别为18°Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx；固定其他工艺条件，发酵5 d 后过滤，通过感官评定和理化指标检测初始发酵糖度对果酒风味的影响，结果见表6。

由表6 可以看出，随着初始糖度的增加，果酒发酵后酒精度也随之升高，说明初始发酵糖度对酒精度影响显著，此外，pH 值也处于一个稳定值，而总酸和吸光度有一定的变化，说明初始糖度对pH值无显著影响，但对总酸和吸光度有影响。分析其中的原因，在玫瑰橙子果酒正常发酵情况下，高浓度糖可以给酿酒酵母提供更多的碳源进行新陈代谢，从而利用原料中的糖合成酒精，当酒精浓度达到一定阶段后对其他香气成分有所压制。以10 人组的感官评定结果得知，初始发酵糖度24°Bx组的综合评分高达90 分，其色泽艳红，无悬浮物；果香、酒香浓郁，纯正协调，酒质平衡，口感柔和。所以，最终选取发酵初始糖度为24°Bx。

这里将语境分为特定话语(问句)所适应的语境和话语建构后新生成的语境两大类。其中每一类又都可以有文本语境和非文本语境。

2.1.6 发酵温度对果酒的影响

设定玫瑰橙子果酒发酵温度分别为22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃；固定其他工艺条件，发酵5 d 后过滤，通过感官评定和理化指标检测发酵温度对果酒风味的影响，结果见表7。

由表7 可以看出，不同发酵温度对果酒的酒精度以及品质有显著影响，发酵5 d 后的玫瑰橙子果酒随着温度升高，酒精度先增高后降低，当发酵温度达到28 ℃时，酒精度达到最高，果酒感官效果达到最佳，然后随着温度升高酒精度下降，果酒品质也随之下降。分析其原因可能是温度较低时酵母的活性受到抑制，代谢不旺盛致使发酵效果较缓慢；当温度较高时，前期发酵较快，酒精度在短时间内快速上升，加上毕赤酵母代谢活动旺盛，酿酒酵母代谢活动受到抑制。以10 人组的感官评定结果得知，发酵温度28 ℃组的感官综合评分高达90分，果酒色泽呈艳红色，澄清透明；果香浓郁；酒体协调。所以，最终选取控制发酵温度为28 ℃。

2.2 正交试验结果及分析

上述单因素试验分析结果表明，初始糖度、混菌添加比例、混菌接种量对果酒品质的影响最大，故以初始糖度（A）、混菌添加比例（B）、混菌接种量（C）进行3 因素3 水平正交实验，其发酵分析结果及感官评分见表8。

由表8 可以看出，感官评分分析各因素的极差值为（RA=12.00）＞（RC=6.66）＞（RB=6.33），即影响玫瑰橙子果酒发酵及品质的主次因素为发酵糖度（°Bx）＞混菌接种量（%）＞混菌接种比例；经理化指标检测第5 组的pH 值最高、总酸含量偏低、吸光度适中，且感官评分最高达到95 分，所以试验的最优组合为A2B2C3。即以发酵初始糖度为24°Bx，混菌接种量为7 %，混菌接种比例为1∶1 得到的玫瑰橙子果酒口感，色泽，香气最佳。

表6 不同初始发酵糖度的果酒理化性质测定结果及综合评分

表7 不同发酵温度的果酒理化性质测定结果及综合评分

表8 发酵条件优化正交试验结果

表9 单菌发酵果酒、混菌发酵理化性质测定结果及综合评分

2.3 验证试验

将单菌发酵果酒和正交试验确定最优条件的混菌发酵果酒进行3 次发酵试验，最后测得结果的平均值见表9。

2.4 玫瑰橙子酒抗氧化性研究

2.4.1 多酚类物质含量的测定结果（图1、图2）

图1 没食子酸标准曲线

图2 单菌发酵与混菌发酵多酚含量对比

将平行测定结果的平均值进行线性回归，得到没食子酸含量（X）与吸光度（Y）之间的直线方程y=12.9x+0.0432（R²=0.9982）。

由图2 可以看出，单菌发酵多酚含量为172.398 mg/L（样品中的总多酚含量以没食子酸计）。混菌发酵多酚的含量为199.385 mg/L，混菌发酵多酚的含量比单菌增加了15.65 %，其原因可能是毕赤酵母在发酵过程中产多酚的能力比酿酒酵母强。

2.4.2 黄酮类物质含量的测定结果（图3、图4）

图3 芦丁标准曲线

图4 单菌发酵与混菌发酵黄酮含量对比

将平行测定结果的平均值进行线性回归，得芦丁含量（X）与吸光度（Y）之间的直线方程y=8.4032x-0.0063（R²=0.9983）。样品中的总黄酮含量以芦丁含量表示。

由图4 可以看出，单菌发酵黄酮含量为36.7568 mg/L，混菌发酵黄酮含量为40.7168 mg/L，混菌发酵较单菌发酵黄酮的含量增加了13.49 %，其原因可能是毕赤酵母的代谢作用使玫瑰、玫瑰茄花萼中的黄酮进一步释放，使得混菌发酵黄酮含量较单菌发酵有所上升。

2.5 GC-MS挥发性香气物质分析

以正交试验确定的最佳发酵条件与单菌发酵条件作比较，研究玫瑰橙子果酒发酵的挥发性香气物质。玫瑰橙子果酒挥发性香气成分的GC-MS检测结果如表10。

由表10 可以看出，单菌发酵的玫瑰橙子果酒共检测出33 种挥发性香气物质，其中醇类物质14种（89.297%）；酯类物质有11 种（3.846%）；酚类物质有3 种（0.766%）；酸类物质3 种（1.139%）；烯类物质2 种（0.109 %）。混菌发酵的玫瑰橙子果酒共检测出33 种挥发性香气物质，其中醇类物质12 种（86.354%）；酯类物质有11 种（3.972%）；酚类物质有3 种（0.830%）；酸类物质4 种（1.571%）；烯类物质2种（0.123%）。此外，混菌发酵的玫瑰橙子酒还产生了乙酸乙酯、丁酸乙酯、苯甲酸乙酯、月桂酸、茴香脑等香味物质。

虽然混菌发酵制成的玫瑰橙子果酒醇类物质和烯类物质含量相对较低，但是酯类物质和酚类物质相对含量较高。混菌发酵产生的(+)-柠檬烯、己酸乙酯、辛酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇含量远高于单菌发酵。许多证据支持柠檬烯在癌症预防和治疗中有作用，由于可抑制胆固醇合成的限速酶活性，从而有可能抑制胆固醇的合成[13]；己酸乙酯具有曲香、菠萝香型的香气[14]；辛酸乙酯具有白兰地酒香味[15]；芳樟醇具有铃兰香气[16]；苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香[17]。

3 结果与讨论

试验表明，混菌发酵橙子玫瑰果酒的最佳配方为：玫瑰花、玫瑰茄的添加比例为1∶1，酿酒酵母、毕赤酵母的接种比例为1∶1，发酵初始糖度为24°Bx，混菌接种量为7%，果酒发酵温度为28 ℃，发酵5 d所得到的玫瑰橙子果酒品质最佳，其色泽优美，香气醇厚，口感柔和。通过抗氧化性实验研究结果得出，混菌发酵后果酒多酚含量为199.385 mg/L，较单菌发酵增加了15.65 %，黄酮含量为40.7168 mg/L，较单菌发酵增加了13.49%。经GC-MS 分析表明，混菌发酵玫瑰橙子果酒多了5 种挥发性香气成分。混菌发酵与单菌发酵相比，所含的同类挥发性香气成分含量大大提高，挥发性风味物质更多。

表10 玫瑰橙子果酒香气成分的GC-MS检测对比结果