一种检测酿酒粮食中总糖碳稳定同位素的方法

张 倩，练顺才，安明哲，谢正敏，叶华夏，魏金萍

（1.五粮液股份有限公司,四川宜宾644000； 2.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室，四川宜宾644000）

一种检测酿酒粮食中总糖碳稳定同位素的方法

张 倩1，2，练顺才1，安明哲1，2，谢正敏1，2，叶华夏1，2，魏金萍1，2

（1.五粮液股份有限公司,四川宜宾644000； 2.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室，四川宜宾644000）

建立一种检测酿酒粮食中总糖碳稳定同位素的方法。利用高温淀粉酶液化酿酒粮食淀粉，提取出总糖，提高了取样均匀度；利用白炭黑的吸附作用，实现了对酿酒粮食液化液的热风干燥，相较于冷冻干燥缩短了时间、降低了成本、减少了能耗；采用元素分析-稳定同位素比质谱联用仪检测酿酒粮食中的总糖碳稳定同位素，稳定性好、精密度高。

酿酒粮食； 稳定同位素比质谱； 总糖碳稳定同位素； 白炭黑

在国际上，稳定同位素技术由于揭示了产品特征化合物原子水平的信息，而该信息与原料、工艺息息相关，因此被广泛应用于蜂蜜、食用油、葡萄酒、果汁饮料等食品的鉴别[1-13]，借鉴于此，稳定同位素技术在白酒鉴别上的运用应运而生[14-16]。白酒的主要有效成分为乙醇，而白酒中乙醇的主要来源是酿酒原材料中的总糖，因此白酒的乙醇δ13C必与酿酒原材料的总糖δ13C同源。前人对这种同源性关系已有研究[17]，但其检测过程采用冷冻干燥酿酒粮食糖化液[17]，耗时长、耗能高，适用于检测时间充裕的样品；本文利用白炭黑的吸附作用，实现了对酿酒粮食液化液的热风干燥，缩短了时间、降低了成本，适用于需要快速检测的样品。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：本地玉米、高粱、大米、糯米、小麦。

材料、试剂：耐高温淀粉酶（105单位）、白炭黑（五粮液自产，使用前以500℃焙烧2 h）、分析纯氧化钙、0.1 mol/L硫酸溶液、IAEA-CH-6（蔗糖，国际原子能机构IAEA，基于V-PDB计算δ13C=-10.449%）、USGS24（石墨，美国地质勘探局USGS，基于VPDB计算δ13C=-16.049%）、锡盒（Thermo Fisher公司PN 24006400）。

主要仪器：FOSS CT410旋风磨、LG10-2.4A离心机、Thermo Fisher Delta V Advantage稳定同位素比质谱仪、Flash 2000-HT元素分析仪。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

（1）用旋风磨将粮食完全粉碎（全能过120目筛网）后，取粮食粉末25 g加入到含150 mL蒸馏水的烧杯中，持续搅拌，将混合物煮成糊状后，加入0.4 mL耐高温淀粉酶，将烧杯置于95℃恒温水浴中，保持搅拌状态对粮食进行液化，直至液化液不再使碘液变蓝为止。

（2）4000 r/min离心10 min分离出液化液，取10 mL液化液并加入0.2 g CaO粉末，混合均匀后放入90℃水浴5 min，以4000 r/min热离心5 min，用0.1 mol/L的硫酸溶液将上清液pH值调节至5.0～6.0后，按照上清液∶白炭黑=2∶1（mL/g）的比例以每秒1滴的速度缓慢滴入白炭黑中（确保吸附上清液后的白炭黑仍呈疏松不黏腻状态），最后放入烘箱中60℃干燥45 min后再升温至100℃干燥45 min，即制成样品。

1.2.2 样品分析

用锡盒包裹样品，以IAEA-CH-6为标准品、USGS24为质控样，采用元素分析-稳定同位素比质谱联用技术（EA-IRMS）检测样品；所述元素分析条件为：进样器He吹扫流量（Reference）为200 mL/min，氧化炉温度为960℃，柱温（Oven）为60℃，载气He（Carrier）流量为110 mL/min；稳定同位素比质谱条件如下：离子源真空为1.3× 10-6mBar，电压为3.06 kV。

在自然界中，13C/12C变化微小，难以测得其真实值，故采用相对测量法表示样品中13C/12C，结果以δ（千分差%）表示：

δ13C=（R样品/RV-PDB-1）×1000。

式中：R样品——样品中13C/12C比值；

RV-PDB——国际基准物质V-PDB的13C/12C比值，13C /12C=（11237.2±90）×10-6。

本发明方法中所有数据均基于V-PDB标准计算。

2 结果与分析

2.1 仪器稳定性

用1.2.1步骤分别处理1份玉米、高粱、大米、糯米、小麦，再取每一种样品的待测样品各6个，按1.2.2步骤检测，结果见表1。

从表1可以看出，将不同酿酒粮食的同一待测样品重复检测6次，结果的标准偏差（STD）均小于稳定同位素精度测试允许值0.15%，说明用EAIRMS测定酿酒粮食中总糖δ13C的稳定性很好。

2.2 方法稳定性

分别取玉米、高粱、大米、糯米、小麦的同一原样各6份，按照1.2的方法对每一种酿酒粮食的6份原样进行前处理和分析，结果见表2。

表1 仪器稳定性实验结果

表2 平行实验结果

从表2可以看出，不同酿酒粮食的6个原样经过平行实验后，检测结果的STD值均小于稳定同位素精度测试允许值0.15%，说明本方法的精密度高、稳定性好。

2.3 干燥方法的影响

分别取玉米、高粱、大米、糯米、小麦的同一原样各2份，1份按照1.2的方法进行前处理和分析；1份在离心分离后用硫酸溶液调节pH值的粮食液化液后，直接采用冷冻干燥法处理样品，其他步骤与1.2的方法相同，实验结果见表3。

表3 干燥方法对实验结果的影响

从表3可以看出，经不同干燥方法处理后，检测结果的STD值均小于稳定同位素精度测试允许值0.2%，数据基本无区别，说明本方法的检测准确度与现有方法相当，热风干燥法对实验结果无影响；另外，本实验中热风干燥耗时远少于冷冻干燥，既降低了成本、又减少了能耗。

2.4 耐高温淀粉酶的影响

分别取玉米、高粱、大米、糯米、小麦的同一原样各3份，前处理和检测方法中，除加入耐高温淀粉的量分别为0.4 mL、0.7 mL、1.0 mL外，其他步骤与1.2的方法相同，实验结果列于表4。

表4 耐高温淀粉酶对实验结果的影响

从表4可以看出，随着耐高温淀粉酶的增加，各样品中总糖δ13C测试值并无明显变化，其STD也均小于稳定同位素精度测试允许值0.15%，说明耐高温淀粉酶的加入不会影响样品总糖δ13C的测试。

3 结论

现有的总糖δ13C的检测过程采用冷冻干燥方法处理酿酒粮食糖化液，耗时长、耗能高，适用于检测时间充裕的样品；本文利用白炭黑的吸附作用，实现了对酿酒粮食液化液的热风干燥，将干燥时间从至少16 h缩短至2 h以内，既降低了成本，又减少了能耗，适用于需要快速检测的样品。本方法稳定性好、精密度高，为酿酒粮食总糖碳稳定同位素的检测提供了新的选择。

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Detection of δ13C of Total Sugar in Liquor-Making Grains

ZHANG Qian1,2,LIAN Shuncai1,AN Mingzhe1,2,XIE Zhengmin1,2,YE Huaxia1,2and WEI Jinping1,2
(1.Wuliangye Co.Ltd.,Yibin,Sichuan 644000;2 Key Lab of Solid-state Fermentation of Nongxiang Baijiu,Yibin,Sichuan 644000,China)

A method for detecting stable carbon isotope ratio(δ13C)of total sugar in liquor-making grains had been developed.The total sugar was extracted by using high-temperature amylase to improve the sampling uniformity.Then white carbon black was used to achieve heat-drying of liquefied liquid.Compared with freeze-drying,heat-drying could shorten the drying time,reduce production costs and decrease energy consumption.Element analyzer-stable isotope ratio mass spectrometry(EA-IRMS)for the detection of δ13C of total sugar in liquor-making grains had the advantages of good stability,high precision,etc.

liquor-making grains;IRMS;δ13C of total sugar;white carbon black

TS262.3；TS261.2；TS261.7

A

1001-9286（2017）06-0071-03

10.13746/j.njkj.2016335

2016-11-10

张倩（1987-），女，硕士研究生，主要从事白酒及其原料的稳定同位素研究。

优先数字出版时间：2017-03-27；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170327.1451.003.html。