薏仁酒糟水解工艺的研究

梅朝阳，胡 康，张 玉，朱正军，陈茂彬

（湖北工业大学生物工程与食品学院，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉430068）

薏仁酒糟水解工艺的研究

梅朝阳，胡 康，张 玉，朱正军，陈茂彬

（湖北工业大学生物工程与食品学院，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉430068）

为确定蛋白酶水解薏仁酒糟的最佳工艺条件，以多肽得率及水解度为指标对4种蛋白酶进行筛选，确定最佳蛋白酶为碱性蛋白酶，并通过单因素实验及正交实验确定其最佳的水解条件底物浓度为6%（m/V），蛋白酶用量为1200 U/g，温度为55℃，pH值为8.5，反应时间为6 h。在此条件下多肽得率68.12%，溶解氮指数为94.02%，水解度为22.05%。

薏仁酒糟； 碱性蛋白酶； 水解条件

薏仁作为我国首批公布的药食同源的食物之一，营养价值极高。薏仁是一种营养平衡的谷物，具有镇痛消炎、清热排湿、消肿利尿、健脾润肺等多种功效[1-4]。薏仁提取物薏仁油具有抗癌活性，其抗癌活性取决于其含有的棕榈酸、月桂酸、硬脂酸以及亚油酸等不饱和脂肪酸[5-9]。有研究表明，植物蛋白的水解产物多肽具有抑菌[10]、抗氧化[11-12]的特性。薏仁中，蛋白含量丰富，且比例与人体协调。田晓等[13]用响应面法考察了料液比、温度和pH值对薏仁蛋白提取的影响，发现料液比对浸提率影响最大。肽作为薏仁蛋白经蛋白酶部分水解的产物，也是人体的重要功能性成分。董红艳等[15]以氮溶解指数(NSI)和水解度(DH)为指标对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶进行筛选，确定碱性蛋白酶为最佳水解用酶,并确定最佳工艺条件为碱性蛋白酶在底物质量浓度39.95 g/L，酶用量1201.75 U/g，温度54.61℃，pH值7.99,反应时间4 h。在此条件下，水解后的氮溶解指数可达95.79%。岳文明等[16]将薏仁蛋白进行酶解后，用不同树脂吸附，其中DA201-C大孔树脂吸附率最高，为46.06%，纯化后的肽相对分子质量为278.61～943.32。薏仁发酵酒具有其特有的香气及较高营养价值，但蛋白质利用极低。酒糟作为薏仁发酵酒的副产物，蛋白含量在37%左右，具有一定的利用价值。通过对蛋白酶进行初步筛选，得到碱性蛋白酶为最佳蛋白酶，并通过单因素及正交实验分析了各因素对水解多肽得率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

脱脂薏仁酒糟：本实验室自制；蛋白酶：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶及复合蛋白酶（诺维信）；其他试剂为分析纯。

仪器设备：数显恒温水浴锅，精宏；FE20实验室pH计，梅特勒-托利多；TG16-WS台式高速离心机，湘仪；AP-01P无油真空泵，奥特赛恩斯；K110OF凯氏定氮仪，海能；L-8900氨基酸分析仪，安捷伦；SOX500脂肪测定仪，海能；TB-204分析天平，赛多利斯；ZXFD-B5250鼓风干燥箱，智诚；移液枪，大龙。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶的初步筛选

称取一定量的脱脂薏仁酒糟，加入适量去离子水进行调浆，分别按照蛋白酶的消解条件（表1）进行水解。在水解过程中不断加入NaOH（HCl）溶液，保持反应过程中的pH值不变（±0.1）。反应6 h后，85℃水浴10 min使蛋白酶失去活性。

表1 蛋白酶的水解条件

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 底物浓度对水解效果的影响

酶添加量为1000 U/g，pH值为8.5，时间为5 h，温度为55℃，底物浓度控制为3%、4%、5%、6%、7%、8%，待水解完成后，以多肽得率为指标，确定最佳的底物浓度。

1.2.2.2 酶添加量对水解效果的影响

底物浓度为5%，pH值为8.5，时间为5 h，温度为55℃，酶添加量控制为600 U/g、800 U/g、1000 U/g、1200 U/g、1400 U/g、1600 U/g，待水解完成后，以多肽得率为指标，确定最佳的酶添加量。

1.2.2.3 温度对水解效果的影响

底物浓度为5%，酶添加量为1000 U/g，pH值为8.5，时间为5 h，温度控制为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，待水解完成后，以多肽得率为指标，确定最佳的水解温度。

1.2.2.4 pH值对水解效果的影响

底物浓度为5%，酶添加量为1000 U/g，温度为55℃，pH值为8.5，时间控制为3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，待水解完成后，以多肽得率为指标，确定最佳的水解pH值。

1.2.2.5 时间对水解效果的影响

底物浓度为5%，酶添加量为1000 U/g，温度为55℃，时间为5 h，pH值控制为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，待水解完成后，以多肽得率为指标，确定最佳的水解时间。

1.2.3 正交实验

由于水解过程受底物浓度、酶添加量、水解温度、水解时间及水解pH值5个因素的影响，为了全面考虑5个因素对水解工艺的影响，利用水解工艺单因素实验为依据，设计L16(45)正交实验，见表2。

表2 薏仁酒糟酶解工艺正交实验因素与水平

1.2.4 理化指标的检测

水分含量按GB 5497—1985测定；脂肪的测定按GB/T 14772—2008；蛋白质含量按GB 5009.5—2010测定；水解液中多肽的测定按GB/T 22492—2008。

1.2.5 多肽得率的测定

1.2.6 水解度的测定

式中：C——水解过程中，所加NaOH的浓度（mol/L）；

V——水解过程中，所加NaOH的体积（mL）；

Mp——底物蛋白质的总质量（g）；

α——氨基酸的平均解离度；

htot——底物蛋白质的肽键总数（mmol/g蛋白质，薏仁酒糟蛋白为8.15 mmol/g）。

1.2.7 溶解氮指数的测定

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶的初步筛选（图1）

图1 蛋白酶种类对水解效果的影响

有研究表明，多肽相对于蛋白质及氨基酸，更容易为人体所吸收。为了提高蛋白质的利用率，在水解过程中，一般多肽的得率越高越好。由图1可知，碱性蛋白酶的水解效果较佳。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 底物浓度对水解效果的影响（图2）

图2 底物浓度对水解效果的影响

薏仁蛋白的水解在不同底物浓度下存在一定的差异，根据酶的特性，在一定底物浓度范围内，底物浓度越高，酶与底物接触越充分，水解效果好；超过一定的范围，底物浓度越高，酶与底物越无法充分接触，水解效果差。由图2可知，当底物浓度为6%时，多肽得率最高，底物浓度高于6%，多肽得率急剧下降，因此，较优的底物浓度为6%。

2.2.2 酶添加量对水解效果的影响（图3）

图3 酶添加量对水解效果的影响

蛋白酶的水解在不同的酶添加量下存在一定的差异，根据酶的特性，在一定的添加范围内，添加量越高，酶与底物接触越充分，水解效果越好，超过一定的范围，过量酶无法与底物充分接触，造成酶的浪费，甚至抑制水解。由图3可知，当酶的添加量为1000 U/g时，多肽得率最高；高于1000 U/g时，多肽得率趋于稳定，有细微的下降趋势。因此，较优的酶添加量为1000 U/g。

2.2.3 温度对水解效果的影响（图4）

图4 温度对水解效果的影响

根据酶的特性，一方面，随着温度的升高，反应速度越快，另一方面，酶的化学本质为蛋白质，温度过高会使蛋白质变性。由图4可知，当温度小于55℃时，随着温度的升高，多肽得率不断增大；当温度大于55℃，多肽得率不断减小。因此，较优的水解温度为55℃。

2.2.4 pH值对水解效果的影响（图5）

图5 pH值对水解效果的影响

根据酶的特性，酶受pH值的影响极为显著，低于或者高于最适pH值，酶的活性迅速降低。由图5可知，当pH值小于8.5时，随着pH值的减小，蛋白酶的活性急剧下降，多肽得率不断减小，当pH值大于8.5时，随着pH值的增大，蛋白酶的活性急剧下降，多肽得率不断减小。因此，较优的水解pH值为8.5。

2.2.5 时间对水解效果的影响（图6）

图6 时间对水解效果的影响

蛋白质的水解分为两个阶段，第一个阶段，蛋白质被分解为小分子的多肽，第二个阶段，小分子的多肽被分解为氨基酸。开始时，随着水解的进行，多肽得率不断增加，当时间达到6 h时，多肽得率达到最大值，继续延长水解时间，多肽的得率有下降的趋势。因此，较优的水解时间为6 h。

2.3 正交实验结果（表3、表4）

由表3极差分析可知，影响薏仁酒糟多肽得率的主次因素为C＞B＞E＞D＞A，即pH值对多肽得率影响最大，其次为酶添加量、时间、温度，对多肽得率影响最小的是底物浓度，得出最佳水解条件组合为A3B3C3D3E3，即底物浓度为6%，酶添加量为1200 U/g，水解pH值为8.5，水解温度为55℃，水解时间为6 h。在该最佳条件下进行水解的验证试验，多肽得率为68.12%。

表3 碱性蛋白酶酶解薏仁酒糟工艺优化正交实验结果

表4 正交实验结果方差分析

由表4可知，在α=0.05的水平上，水解pH值的F值＞F临界值，所以水解pH值对水解影响显著。

3 结论

通过蛋白酶的初步筛选，确定最佳蛋白酶为碱性蛋白酶，通过单因素及正交实验，确定碱性蛋白酶的最佳水解条件：底物浓度6%，酶添加量为1200 U/g，水解pH值为8.5，水解温度为55℃，水解时间为6 h。在此水解条件下，多肽得率为68.12%，溶解氮指数为94.02%，水解度为22.05%。

一般来说，内切蛋白酶容易产生苦味，外切蛋白酶可以降低苦味。为了降低苦味，可以考虑碱性内切蛋白酶和风味外切蛋白酶结合使用，这样可以得到低苦味值的生物活性肽。再根据生物活性肽的相应性质，将其添加到食品中，制成具有一定功效的功能食品，这样既可以为酒厂酒糟的利用提供新的途径，为企业带来附加值，又可以开发新的产业链。

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Hydrolysis of Spent Grains of Coixseed Wine

MEI Zhaoyang,HU Kang,ZHANG Yu,ZHU Zhengjun and CHEN Maobin
(Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,School of Biological Engineering, Hubei University of Technology,Wuhan,Hubei 430068,China)

In order to determine the best hydrolysis conditions of spent grains of coixseed wine lees by protease,four kinds of protease were screened with peptide yield and hydrolysis degree as the evaluating indicators.As a result,alcalase was the best protease. The best hydrolysis conditions of alcalase were determined by single factors test and orthogonal test as follows:substrate concentration was 6%(m/V),the use level of alcalase was 1200 U/g,temperature was at 55℃,pH was 8.5,and hydrolysis time was 6 h.Under above conditions,the yield of peptide and nitrogen solubility index were 68.12%and 94.02%,and the degree of hydrolysis reached up to 22.05%.

spent grains of coixseed wine;alcalase;hydrolysis conditions

TS262.3；TS261.4；X797

A

1001-9286（2017）06-0103-05

10.13746/j.njkj.2017025

香溢城活性肽酒新产品开发与生产关键技术；国家重点研发计划重点专项(2016YFD0400500)。

2017-02-14

梅朝阳（1990-），男，在读硕士研究生，主要从事食品发酵研究工作，E-mail：592277301@qq.com。

陈茂彬（1965-），男，教授，博士，主要从事食品发酵研究工作，E-mail：hgchenmaobin@163.com。

优先数字出版时间：2017-05-26；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170526.1356.002.html。