超高效液相色谱-串联质谱法测定酒类中纽甜

时间：2024-05-28

黄坤，王幸平，范小龙，吴婉琴，王会霞，郭嘉

(1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北武汉430075； 2.湖北生物医药产业技术研究院有限公司，湖北武汉430075； 3.武汉工程大学绿色化工过程教育部重点实验室，湖北武汉430074)

纽甜（neotame）是一种新型的强力甜味剂，甜度约为蔗糖的10000倍、阿斯巴甜的40倍，其甜味纯正，无苦味和金属味，且价格相对便宜，因此广泛应用于各类食品中[1]。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定纽甜可在各类食品中按规定使用，但根据要求纽甜在黄酒、米酒以及果酒中可适量使用（≤0.033 g/kg），而在白酒和葡萄酒中则不得使用[2]。

目前最常用的食品中纽甜的检测方法有高效液相色谱-紫外检测法[3-5]、高效液相色谱-蒸发光散射法[6]、流动注射法[7]等，其中最常用的是高效液相色谱法，目前已有国家标准GB 5009.247—2016[8]，该方法取代了旧标准GB/T 23378—2009，但标准适用范围缩小，不再包括酒类，同时该方法操作复杂，灵敏度不高，且使用离子对试剂检测系统平衡时间较长，不适用于酒类中纽甜的快速检测。因此建立一种酒类中纽甜快速测定的液相色谱-质谱/质谱法十分有必要，能为酒类的监管提供科学依据，从而保证酒类的饮用安全，有效地促进酒类市场健康有序的发展。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

样品：市售白酒、葡萄酒、黄酒、米酒、果酒各类酒品。

仪器设备：超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪（XEVO TQ-S），美国Waters公司；Masslynx 4.1色谱质谱管理软件；电子天平（ME2002E、XS204），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；翻转式混匀器（Trayster digital），德国艾卡公司；离心机（Allegra X-15R），美国贝克曼库尔特有限公司。

试剂：纽甜（纯度98.0%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲酸（色谱级），美国Thermo Fisher Scientific公司；超纯水（自制）。

1.2 标准溶液的配制

准确称取纽甜标准品，用超纯水溶解并定容，配制成质量浓度为100µg/mL的标准储备溶液；准确移取1.0 mL标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用超纯水稀释配制成1µg/mL的标准工作溶液；用流动相再逐级稀释成适当质量浓度的系列标准工作溶液。

1.3 样品溶液的制备

称取酒类样品5 g左右水浴除酒精后置于50 mL离心管中，加入30 mL的超纯水，翻转混匀30 min后定容至刻度，以4000 r/min离心5 min，过0.22µm的有机系滤膜，取滤液供测定。

1.4 液相及质谱条件

1.4.1 LC条件

WatersBEHC18色谱柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；流动相由乙腈和0.1%的甲酸水溶液组成，流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序0 min，乙腈的体积分数为5%；0～0.3 min，乙腈的体积分数保持为5%；0.3～0.8 min，乙腈的体积分数从5%升至65%；0.8～3.2 min，乙腈的体积分数从65%升至95%；3.2～3.3 min，乙腈的体积分数保持为95%；3.3～3.4 min，乙腈的体积分数从95%降至5%；3.4～5.0 min，乙腈的体积分数保持为5%。柱温为40℃；进样体积：5µL。

1.4.2 MS-MS条件

质谱仪选择电喷雾离子源，负离子模式，毛细管电压为2.50 kV，脱溶剂气和锥孔气流量分别设定为700 L/h和50 L/h，离子源温度和脱溶剂气温度分别为150℃和350℃。

1.5 定性及定量

将上述标准工作溶液和样品溶液在1.4方法下测定，根据保留时间和相对离子丰度比进行定性，以标准溶液浓度对定量离子对的峰面积绘制标准曲线，外标法定量。

2 结果与分析

2.1 色谱和质谱参数的选择

2.1.1 色谱参数的选择

通过实验室前期使用高效液相色谱-二极管阵列检测器对纽甜的检测发现，乙腈-磷酸氢二钠流动相体系分离效果较好，但由于磷酸氢二钠不易挥发，不适宜质谱分析。本研究分别考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%乙酸铵、乙腈-水、乙腈-0.1%三乙胺作为流动相进行样品测定。结果表明，除乙腈-0.1%三乙胺流动相体系信号响应略低外，各体系差异不大，综合分离效果、响应强度和测定时间考虑，最终选择乙腈和0.1%的甲酸水溶液作为流动相进行洗脱，纽甜的峰型对称，保留时间适宜。

2.1.2 质谱参数的选择

通过流动注射进行质谱全扫描得到纽甜的一级质谱图，用氩气轰击母离子得到二级质谱图，实验表明，纽甜在负离子模式下响应值高于正离子模式，对纽甜的定性和定量离子进行质谱参数优化，所得最佳质谱参数见表1。在优化的色谱和质谱条件下纽甜的总离子流色谱图和子离子流色谱图见图1。

表1 纽甜的质谱分析参数

图1 纽甜标准溶液的总离子流图和子离子流图

2.2 样品前处理条件的选择

白酒、葡萄酒、黄酒、米酒以及果酒等酒类样品基质较为复杂，且含有一定比例的乙醇，直接进样分析，会影响保留时间和峰型，导致检测结果的准确性和重复性不佳。本方法采用水浴除酒精后稀释进样，可以降低基质效应，考虑到检出限的原因稀释倍数定为10倍（米酒样品可视浑浊情况采取离心后称量或增大稀释倍数特殊处理）。

2.3 方法的线性范围和检出限

将标准工作溶液用流动相稀释，分别配制成质量浓度为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的系列标准工作溶液，按照1.4和2.1所确定的色谱和质谱条件进行检测，以标准溶液浓度C对定量离子对的峰面积Y绘制标准曲线。结果表明，纽甜质量浓度在1～50 ng/mL浓度范围内线性关系良好，线性回归方程：Y=1676.03C-169.22，R2=0.991。纽甜标准溶液谱图如图1所示。以S/N=3结合实际基质情况确定检出限为0.05 mg/kg。

表2 5种酒类中纽甜的加标回收率和相对标准偏差(n=5)

2.4 方法的精密度和回收率

准确称取一定量的白酒、葡萄酒、黄酒、米酒以及果酒等酒类样品，用微量移液器分别准确加入浓度为0.050 mg/kg和0.200 mg/kg的纽甜标准溶液，按1.3项下的实验条件处理得到的样品溶液进行测定，5种酒类每个加标浓度进行5次重复实验，计算其回收率和相对偏差，结果见表2。结果表明，纽甜的回收率为76.90%～101.55%，相对偏差小于8%，方法的准确度和精密度均符合实验测定需求。

2.5 实际样品的测定

按本文所建立的方法，分别对实验室计划监测的白酒（阳性样）、葡萄酒、黄酒、米酒（阳性样）以及果酒等5个样品进行了检测，结果测得白酒和米酒中纽甜的浓度分别为0.827 mg/kg和1.02 mg/kg，均为市售较为低档的酒类，说明市售的相关酒类产品存在非法添加纽甜的可能性，同时也表明对该项目的风险监测与评估显得尤为必要。