黄水抗氧化活性的初步研究

张富勇，苏 建，刘 阳，安明哲

（四川宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾644000）

浓香型白酒生产过程中，入窖发酵糟醅的含水量为52%～55%，随着发酵的进行，糟醅中的营养物质在微生物和酶的作用下分解转化，生成的水与糟醅中原有的水分沉积、汇聚于窖池底部，发酵结束后起糟操作时，通过打坑、开槽将水分渗出，采用泵或者人工舀出，此类液体一般呈黄褐色，生产上称为黄水。黄水中通常含有1%～2%的残余淀粉，0.3%～0.7%的残糖，4%～5%的乙醇，以及有机酸、白酒香味成分及前体物质等，具有较高的利用价值[1]。

目前对黄水的研究大多局限在呈香呈味物质的提取利用，尚未有对黄水抗氧化活性及相关物质的报道。众所周知，国内外对葡萄酒、黄酒和啤酒的抗氧化活性及功能性物质的研究常有报道。目前国内对白酒的抗氧化活性及健康因子的研究日益趋热，但因白酒属于蒸馏酒，蒸馏导致白酒抗氧化活性较低、白酒中抗氧化物质含量较少[2]。本研究通过利用DPPH自由基清除法及总抗氧化测定对黄水的抗氧化活性进行测定，对初步分离得到的黄水粗多糖及黄水清液进行抗氧化活性测定，探索黄水抗氧化活性的分布。为今后进一步资源化利用黄水中的抗氧化活性物质提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

黄水、浓香型白酒，五粮液酒厂；黄酒，绍兴产黄酒；没食子酸、维生素C，国药集团；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Folin-酚试剂，美国sigma公司。

离心机5810R、分光光度计，美国Eppendorf公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化厂；冷冻干燥仪，德国德蒙christ冷冻干燥机。

1.2 方法

1.2.1 黄水DPPH自由基清除能力的测定

参照沈赤等[3]的方法，配制0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液、1 g/L的维生素C、没食子酸溶液，避光4℃保存，现配现用。空白比色管中加入2 mL超纯水，100 μL待测样品，混匀。最后向上述体系中准确加入2 mL DPPH自由基溶液，充分混匀。于室温避光静置30 min后，在517 nm处测定吸光值变化。用1 g/L没食子酸和维生素C作为阳性对照，白酒和黄酒作为参照。按下式计算清除率：清除率（%）=（1-A1/A0）×100 ；其中：A1为待测样存在时的吸光度；A0为对照样的吸光度。

1.2.2 黄水总抗氧化能力的测定

参照王晓宇等[4]使用的亚油酸体系，准确量取2.5 mL K3PO4缓冲液（0.04 mol/L，pH7.0）和2.5 mL亚油酸乳状液于5 mL比色管中，混匀。向上述体系中加入200 μL待测样，充分混匀。将混合反应液放入37℃培养箱中避光培养，每12 h取样100 μL，共取5次。用硫氰酸盐法检测反应体系的氧化程度。检测方法：取样品溶液100 μL加入到4.7 mL乙醇（75%vol）中，然后加入100 μL硫氰酸铵（30%）和100 μL FeCl2（浓度为20 mmol/L，溶于3.5%HCl中）混匀，在500 nm处测定吸光值变化。用2.5 mL的K3PO4缓冲液与2.5 mL的亚油酸乳状液混合作空白对照，用1 g/L Vc、没食子酸作为阳性对照，用白酒和黄酒作为参照。

按下式计算氧化抑制百分率：氧化抑制率（%）=（1-A1/A0）×100；其中：A1为待测酒样存在时的吸光度；A0为对照样的吸光度。

1.2.3 黄水粗多糖的制备及抗氧化活性测定

黄水粗多糖的制备参照绍兴黄酒多糖提取的方法[5]并进行改进，取400 mL新鲜黄水进行减压浓缩、浓缩至100 mL（即浓缩比为4.0），乙醇浓度为80%vol、醇沉时间为24 h、醇沉温度为4℃，离心收集多糖，将收集得到的粗多糖进行冻干，计算黄水粗多糖得率；将得到的黄水粗多糖用去离子水还原至400 mL，并测定其DPPH自由基清除能力及总抗氧化能力。

1.2.4 黄水除多糖后清液（醇沉液）的抗氧化活性及总酚测定

对醇沉离心后所得的上清液进行减压浓缩、挥发去除用于醇沉的乙醇，将上清液体积控制在100 mL左右，并用去离子水还原至黄水原体积（400 mL）即为黄水清液，测定其DPPH自由基清除能力及总抗氧化能力，同时测定黄水清液中总酚的含量，总酚测定采用Folin-Ciocalteu法测定[6]。

2 结果与分析

2.1 黄水DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种以氮为中心的有机自由基，其性质稳定、呈深紫色，在517 nm处的吸收较强。当抗氧化物质提供的电子与DPPH电子配对时，溶液颜色变浅，517 nm处的吸收消失，反映了自由基被清除的情况，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系。因此，可以较迅速地评价物质的抗氧化能力。测定结果如图1所示：在相同条件下，100 μL Vc、没食子酸、白酒、黄酒和黄水对DPPH的清除率分别是65.4%、78.0%、9.2%、43.7%、55.7%。结果表明，黄水的DPPH自由基清除能力较强甚至强于黄酒，但白酒的DPPH自由基清除能力较弱。这与文献报道的DPPH自由基清除率为“啤酒＞葡萄酒＞黄酒＞白酒”基本一致[7]。

2.2 总抗氧化能力

总抗氧化能力是通过样品对亚油酸的自氧化作用的抑制来测定的。在亚油酸的自氧化过程中，会产生过氧化物。这些过氧化物会将Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+与SCN-形成络合物，于500 nm处有最大吸光值。因此，吸光值越高，表明亚油酸自氧化的程度越高。加入待测样品后，通过硫氰酸盐法测定的亚油酸自氧化程度的吸光值。测定结果如图2所示：100 μL Vc、没食子酸、白酒、黄酒和黄水，反应时间为60 h时，氧化抑制率分别为76.7%、90.1%、10.3%、45.6%、63.8%。结果表明，亚油酸体系测定的上述样品氧化抑制率普遍高于DPPH自由基清除率，且氧化抑制率强弱程度与DPPH自由基清除率相一致。同时表现出黄水的抗氧化能力较强，甚至强于黄酒，明显高于白酒，也与现有研究发现的黄酒氧化抑制率[8]为60%～99%相一致。

图1 黄水及参照物的DPPH自由基清除率

图2 黄水及参照物的总抗氧化力

2.3 黄水粗多糖的制备及抗氧化活性测定

参照绍兴黄酒多糖提取的方法并进行改进：浓缩比为4.0，乙醇浓度为80%vol、醇沉时间为24 h、醇沉温度为4℃，离心收集多糖，400 mL新鲜黄水经醇沉提取、冷冻干燥后得到1.64 g黄水粗多糖，得率为0.41%。将冻干的黄水粗多糖用去离子水再溶至400 mL后测得的抗氧化能力如图3所示：黄水粗多糖的DPPH自由基清除率为18.1%、氧化抑制率为31.3%，这说明经过醇沉得到的黄水粗多糖在功能上类似于植物多糖，但抗氧化能力仍略低于文献报道的绍兴黄酒多糖200 mg/L的53%氧化抑制率。可以在后续的试验中对黄水粗多糖进行浓缩、精制，进一步研究提升黄水多糖的抗氧化功效。

图3 黄水粗多糖抗氧化能力

2.4 黄水除多糖后清液（醇沉液）的抗氧化活性及总酚测定

对醇沉离心后所得的上清液进行减压浓缩、挥发除去加入的乙醇，将上清液体积控制在100 mL左右，并还原至黄水体积（400 mL）制备成黄水清液，测定其DPPH自由基清除能力及总抗氧化能力，结果见图4。黄水清液的DPPH自由基清除率达到31%、氧化抑制率为38.9%，较高于黄水粗多糖，具有较为明显的抗氧化能力。同时采用Folin-Ciocalteu法测定清液中总酚的含量为480 mg/L，接近于相关文献报道的黄酒总酚含量400～900 mg/L，进一步印证了黄水清液的抗氧化能力。

图4 黄水清液抗氧化能力

2.5 黄水抗氧化能力的分布

通过减压浓缩、醇沉多糖等操作将新鲜黄水分离成黄水粗多糖和黄水清液两个组分，分别对两个组分进行再溶、还原至原黄水体积以便更为直观的与原黄水对比，两组分与黄水的DPPH自由基清除效果及总抗氧化能力如图5所示。黄水的抗氧化活性在黄水粗多糖及黄水清液中均有分布和体现，但主要分布于黄水清液中。造成黄水抗氧化活性分布特性原因主要与白酒的生产方式有关，白酒生产一般采用以单粮或多粮为原料，利用酒曲中的多种微生物共同作用，经陈年泥窖长期发酵而成。原料中未被利用的多糖、维生素类、酚类等化合物以及长期缺氧发酵代谢过程中产生的微生物多糖、还原性物质等，这些物质依附于糟醅进入水相环境，由于不易挥发从而被保留在黄水中。实验中测定的黄水粗多糖及总酚可以说明黄水的抗氧化能力，但是其他存在于黄水中的抗氧化物质，如氨基酸、小分子肽类、烯萜类也有可能具有抗氧化作用，具体成分尚待进一步研究，为拓宽白酒抗氧化活性物质、提升白酒健康功效提供支撑。

图5 黄水抗氧化能力分布

3 结论

通过DPPH自由基清除能力、总抗氧化能力两种指标间接测定黄水及分离的黄水两大组分。研究结果表明，黄水中含有的组分具有明显强于白酒的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力，蒸馏是导致白酒抗氧化能力偏低的主要原因，表明具有抗氧化活性的物质难以挥发；黄水的抗氧化活性物质主要分布在黄水清液中，但黄水多糖仍有一定的抗氧化能力。初步推测，酚类化合物是引起黄水抗氧化活性的主要物质，然而由于黄水经过长时间缺氧发酵其成分极为复杂、存在多种类型的还原性物质，具体是哪一种抗氧化活性成分、哪些是可以高效利用，尚待今后进一步的深入研究。