功能微生物在酱香大曲白酒生产中的应用

韩兴林，刘建华，栗 伟，程相国，陈 彬，胡景辉

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京100015；2.黑龙江北大仓集团有限公司，黑龙江齐齐哈尔161005；3.黑龙江省轻工科学研究院，黑龙江哈尔滨150010；4.中粮黑龙江酿酒有限公司，黑龙江肇东152000）

中国的白酒，是以粮食谷物为主要原料，以大曲、小曲、麸曲或者酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒[1-3]。作为传统产业的中国白酒具有特色鲜明的产品属性和文化属性，除了饮用之外，更具有丰富独特的精神文化魅力[4-5]。而酱香型白酒更是其中的佼佼者，其工艺复杂繁琐，以酱香突出、幽雅细腻，入口柔绵醇厚，回味悠长著称，以高粱、小麦为原料，以小麦踩制之中高温大曲为糖化发酵剂，经高温堆积、高温发酵、高温流酒、长期贮存、精心勾兑而成[6-8]。

酱香型白酒中的酒曲、酒醅、窖泥中含有大量的微生物，而这些微生物，特别是一些功能微生物对酱香型白酒的品质起到至关重要的作用[9-11]。例如谢和等[12]以酱香白酒的大曲出发，经过分离纯化得到8株产酱香菌株，经过研究得出这些菌株为芽孢杆菌。庄名扬等[13]从酱香酒曲中分离到1株利于酒体香气形成的菌株，经过鉴定为地衣芽孢杆菌。张荣等[14]从大曲中筛选得到3株菌株，均产酱香，经过分子鉴定确定为地衣芽孢杆菌。而在其他香型白酒中，功能微生物也对酒体起到重要作用，例如刘桂君等[15]从清香酒曲中筛选得到地衣芽孢杆菌，并将其添加到酒醅中发酵产二锅头基酒，其中乙酸乙酯含量明显提高。不仅如此，该基酒中的乳酸乙酯含量降低，酒体还十分协调、自然。王丽等[16]研究了汾酒大曲，筛选得到42株菌株，经过筛选得到1株耐高温蛋白酶活性较高的菌株。

因此将一些功能微生物合理的应用到正常白酒酿造生产中，将会改善白酒的口感，提高其品质。本研究将功能微生物应用至酱香型白酒，并取得了良好的效果，提高了白酒品质。

1 材料与方法

1.1 材料

实验室保藏菌种：细菌BX01—BX08，酵母BF01—BF03、BZ01—BZ03。

1.2 试验方法

1.2.1 实验室酒醅最佳发酵温度及时间的测定

取入窖酒醅，在不同温度（25℃、30℃、35℃）下培养发酵不同时间（7 d、14 d、21 d）后，取100 g酒醅蒸馏100 mL酒样，测定溜出液的酒精度、总酸含量、总酯含量，每个条件做3个平行，以确定实验室酒醅最佳发酵温度及时间。

1.2.2 混合细菌菌株的实验室发酵实验

（1）细菌间相互抑制作用

将功能菌库中的细菌BX01—BX08，两两配对，点接于酪素平板上，使其间距在1.5～2.5 mm之间，以37℃培养24 h、48 h后，观察记录其生长情况。

（2）混合细菌强化实验室酒醅发酵

制备单株细菌液，按要求分别混合3种细菌液为1组，共26组，每组2个平行，总接种量为7.5%的强化实验室发酵酒醅，35℃下培养发酵21 d后，取酒醅蒸馏，测定酒精度，总酸、总酯含量。

（3）强化酒醅馏出液中四甲基吡嗪含量测定将酒样先用酒精浸提后浓缩，顶空固相微萃取后，进入气相色谱测定四甲基吡嗪含量。

1.2.3 混合酵母菌株的实验室发酵实验

将发酵酵母BF01—BF03分别与产酯酵母BZ01—BZ03两两组合强化酒醅，分别制备酵母菌液，总接种量10%，以35℃发酵21 d，蒸馏酒醅，测定其酒精度，总酸、总酯含量，60%色谱纯酒精稀释10倍后，进行色谱测定。

1.2.4 混合细菌菌株的入窖生产实验

将BX01—BX03分别经过三级培养后强化酒醅，细菌总数109个/mL，混合后总接种量为窖池总料的3‰，接种方式：直接入窖与堆积入窖，以同一排次另一窖池作对照组，出窖蒸酒单独保存，贮存一段时间后，测定其酒液各项指标。

1.2.5 混合酵母菌株的入窖生产实验

将BF01、BZ03分别经过三级培养后强化酒醅，酵母总数达108个/mL，混合液体接种，总接种量为窖池总料的3‰，直接拌酒醅入窖，以同一排次另一窖池作对照组，出窖蒸酒单独保存，贮存一段时间后，测定其酒液各项指标。

1.3 试验窖池

28个生产窖池，砖地泥窖，窖龄均在40年以上，窖池长3.6 m，宽3 m，深4 m，每个窖池料醅量约为17.5 t。从1#—28#中随机挑选9个窖池作生产应用试验窖池，分别为 2#、5#、8#、10#、13#、17#、20#、23#、27#，其中 5#、17#、23#窖池做混合酵母菌株强化入窖酒醅实验，2#、8#、20#窖池做混合细菌菌株强化入窖酒醅实验，10#、13#、23#做混合细菌菌株强化堆积酒醅实验，强化第5排酒醅，蒸酒后单独留样保存，用余下的窖池做参照进行对比。酿造酱香型白酒的6个排次结束后，计算每个窖池的原料出酒率（以65%vol酒精计）。

2 结果与讨论

2.1 实验室酒醅最佳发酵温度及时间的测定

由实验室酒醅发酵实验可以得出，在不同温度下，时间在21 d的酒醅发酵最好，25℃酒醅发酵较差，30℃、35℃酒醅发酵后酒精含量、总酸含量接近，而总酯含量相差明显，35℃酒醅发酵最佳，所以之后的酒醅发酵均选在35℃培养发酵21 d。

2.2 混合细菌菌株的实验室发酵实验

2.2.1 细菌间抑制作用

28组细菌组合培养24 h后，有些组细菌已经相结合，有些组细菌正相互结合，而有些组分开生长明显。再经48 h培养，生长情况如表1所示，细菌间14组、24组、25组、35组、36组、37组相互排斥生长，其余组细菌均相融合。

根据细菌间抑制实验结果，选择混合3株细菌有：123、126、127、128、138、156、157、158、167、168、178、238、267、268、278、348、456、457、458、467、468、478、567、568、578、678。

表1 48 h后细菌间相互抑制作用结果

表2 混合细菌强化酒醅实验结果

2.2.2 混合细菌强化实验室酒醅发酵

26组混合细菌强化实验结果见表2。根据总酯含量大小顺序排列，前8位的组合有156、268、128、123、457、478、168、468，且总酯含量在0.7 g/L以上，空白对照组酒精度、总酸含量、总酯含量分别是2.9%vol、0.53 g/L、0.50 g/L，将这8组样品及空白对照保留作色谱实验。

2.2.3 强化酒醅馏出液四甲基吡嗪含量测定（图1）

由图1可知，各强化馏出液中四甲基吡嗪的含量均大于空白组，表明强化后的酒醅均能提高四甲基吡嗪含量。其中，123组提高程度最高，实验室强化酒醅中四甲基吡嗪含量是空白酒醅的1.8倍，这与蛋白酶活力高有一定关系。所以选择123组做混合细菌菌株的入窖试验，进一步对混合细菌的应用效果加以确认。

图1 馏出液四甲基吡嗪含量测定结果

2.3 混合酵母菌株的实验室发酵实验（图2）

图2是发酵酵母与产酯酵母混合强化酒醅结果，F1Z3组合酵母，发酵后酒精含量略高于空白对照，乙酸乙酯含量提高，异戊醇含量超过空白，但相对不高，所以此组合是能在提高白酒风味的同时不影响出酒率，是发酵的最佳组合，所以混合酵母菌株入窖选择组合F1Z3。

2.4 混合细菌菌株、酵母菌株的入窖生产实验

表3是试验酒厂和参照窖池的第5排基酒的各

成分平均值。6个排次结束后，计算每个窖池的原料出酒率（以65%vol酒精计），参照窖池的平均出酒率为24.4%，通过F1Z3混合酵母加强的3个试验窖池出酒率分别为25.3%、24.2%、24.9%，说明混合酵母试验未影响出酒率，而且结果如表3所示，测定出的酯类中甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯、己酸丁酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯9种酯类的含量提高，同时高级醇类的含量（仲丁醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、活性戊醇、异戊醇、正戊醇、2-戊醇）有所下降。1Z3混合酵母强化酒醅试验得到了初步成功验证。混合细菌的实验结果，表明上述实验方式均未影响出酒率，出酒率详见表4，两种强化方式与参照窖池对比，均起到了提高四甲基吡嗪含量的作用，且两种方式的提高程度不同，直接强化酒醅提高了4%，而堆积强化方式提高了12%，分析认为，123组混合细菌菌株在堆积期间得以繁殖生长，成为了入窖时的强势细菌群，菌种高产蛋白酶，分解更多原料中的蛋白质生成四甲基吡嗪的前体氨基酸，使得菌种能够加以利用，产生更多的四甲基吡嗪。

表3 混合功能菌株强化酒醅入窖实验

图2 混合酵母强化酒醅实验测定结果

3 结论

混合酵母试验中，在未影响试验窖池的出酒率情况下，提高了白酒中酯类物质的含量，其中分别有甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯等9种酯类，乙酸乙酯是我们考查的重点酯类物质，其含量提高了18.9%，同时高级醇类中正丙醇的含量下降了3.9%，异戊醇的含量下降了30.7%，故F1Z3混合酵母强化酒醅试验取得了初步的成功。而混合细菌的试验证明了细菌在强化堆积酒醅时，有较强的提高四甲基吡嗪含量的作用。

表4 试验窖池与参照窖池的酱香型白酒的原料出酒率(65%vol酒精计)

经过前期的实验室酒醅发酵实验的摸索，以及最近混合菌种的测试探索，选出混合酵母F1Z3组和混合细菌123组进行生产应用试验。入窖试验分别是混合细菌直接入窖、混合细菌堆积入窖、混合酵母直接入窖试验，3组试验与对照组比较均有不同程度的提高。细菌强化酒醅试验有助于白酒中四甲基吡嗪含量的提高，堆积入窖的强化方式提高较高，使四甲基吡嗪含量提高了12%，直接入窖的强化方式使四甲基吡嗪含量提高了4%。酵母强化酒醅试验在没有影响出酒率的前提下，9种酯类得到了不同程度的提高，8种高级醇类含量有所降低。所以，功能菌库中优良菌种的生产应用试验取得了初步成功。