蓝莓红酒发酵工艺条件的优化

聂文强，吴天祥，2，邹 雪

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学明德学院，贵州贵阳550025；3.贵州医科大学附属医院临床医学研究中心，贵州贵阳550001）

蓝莓红酒作为一种特殊的浆果发酵果酒，它有独特的风味与营养成分。首先，蓝莓红酒具有鲜艳诱人的紫红色，满足了消费者对果酒的感官享受。其次，蓝莓红酒具有果香清香优雅，酸爽平衡的口感，满足消费者特别是女性消费者需求。并且，科学的发酵工艺所生产的蓝莓红酒，富含多种有益健康的矿物质、维生素、氨基酸、微量元素及有机酸等，具有营养价值高、糖分低、酒度低的特点，其中所含的高水平的抗氧化物，有助于提高免疫力，抵抗疾病的特点[1-3]。

本研究以贵州麻江蓝莓为原料，采用单因素及正交试验对蓝莓红酒酿造工艺参数进行优化，旨在探讨影响蓝莓红酒发酵的诸因素，为蓝莓红酒的工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌种：本实验室筛选后保藏菌株Z2以及活性干酵母，市售；酵母详细信息见表1；蓝莓，采自贵州省麻江县蓝莓种植基地。

表1 红酒实验活性干酵母简介

试剂：乙酸正丁酯标准品，1+1盐酸溶液，没食子酸，单宁酸，NaOH（200 g/L）标准液，NaOH（0.05 mol/L）标准液，斐林溶液Ⅰ、Ⅱ液，葡萄糖标液，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，福林-肖卡试剂，福林-丹尼斯试剂，白酒混合标准品（mg/L）由中国科学院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心提供。果胶酶EX-V，购于拉曼公司。

仪器设备：pH计；恒温培养箱；摇床；手持糖度计；净化工作台；数显鼓风干燥箱；高压蒸汽灭菌锅；电子分析天平；紫外可见分光光度计；水浴锅；安捷伦气相色谱仪附FID检测器；AT.LZP-930白酒专用色谱柱，规格25 m×0.32 m×0.25 μm。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 最佳pH值的选择

冷冻蓝莓升温至室温,破碎打浆，加入40 mg/L的SO2，调整糖度至22 °Bx，调整pH值为2.9、3.2、3.5、3.8、4.1，加入4 g/L橡木粉，加入600 mg/L磷酸氢二铵，加入10 mg/L LAFASE HE果胶酶，28℃浸渍1 h，70℃加热处理30 min钝化果胶酶。研究发酵pH值对蓝莓红酒中甲醇、杂醇油、感官品质的影响，选择最佳发酵pH值，每组两个平行。

1.2.1.2 最佳发酵温度的选择

调整pH值为3.5，调整糖度至22°Bx，调整温度为19℃、22℃、25℃、28℃、31℃。研究发酵温度对蓝莓红酒中甲醇、杂醇油、感官品质的影响，选择最佳发酵温度，每组两个平行。其他条件同1.2.1.1。

1.2.1.3 最佳糖度的选择

调整pH值为3.5，调整温度为25℃，调整糖度为16 °Bx、19 °Bx、22 °Bx、25 °Bx、28 °Bx，研究糖度对蓝莓红酒中甲醇、杂醇油、感官品质的影响，选择最佳糖度，每组两个平行。其他条件同1.2.1.1。

1.2.2 正交实验设计

在单因素实验结果的基础上，进行正交实验。正交实验的表头设计选取4因素3水平表L9(34)，pH值为3.2、3.5、3.8，发酵温度为25 ℃、28℃、30℃，糖度为19 °Bx，22 °Bx，25 °Bx，试验设置两个重复；实验结果的主要参考指标为甲醇、杂醇油含量与感官评价。之后对品评结果进行统计分析。

1.3 分析方法

1.3.1 基本理化指标

pH值：酸度计法；总糖：直接滴定法；总酸：电位滴定法；酒精度：密度瓶(GB/T 15038—2006)。

1.3.2 色度

色度测定：样品经0.45 μm孔径滤膜过滤后，测定其pH值，用相同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释10倍后于分光光度计上全波段扫描（400～700 nm）确定最大吸收峰；在420 nm、620 nm和最大吸收峰处分别测定吸光值，将三者吸光值相加乘以10即得色度值[4]。

1.3.3 单宁

单宁，福林-丹尼斯法[5]：以单宁酸为标准品，以吸光度为纵坐标，以不同单宁酸浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，见图1。

样品的测定：吸取10 mL酒样稀释到100 mL，然后再取1 mL进行处理后在760 nm波长处测定吸光度。

1.3.4 总酚

采用福林-肖卡法(GB/T 10345—2007)，以没石子酸为标准品，以吸光度为纵坐标，以不同没石子酸浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，见图2。

图1 单宁含量标准曲线图

图2 总酚含量标准曲线图

样品测定：吸取10 mL酒样先稀释到100 mL，然后再取1 mL进行处理后在765 nm波长处测定吸光度。

1.3.5 花色苷

pH示差法[6]：用移液管吸取5 mL酒样，稀释到50 mL，再从稀释液中取2 mL，分别用 pH1.0的KCl-HCl混合液和pH4.5的NaAc-HAc缓冲溶液稀释至10 mL混匀，以等量溶剂加相应缓冲溶液做空白样，测定520 nm和700 nm处吸光值。总花色苷的含量以矢车菊色素-3-葡萄糖苷计，按下式算：

其中：n表示稀释倍数；449.2是矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔质量；26900是矢车菊色素-3-葡萄糖苷的消光系数。

1.3.6 甲醇及杂醇油

采用气相色谱分析，氢火焰离子化检测器，以白酒标样标准图谱的各组分保留时间定性，乙酸正丁酯峰面积内标法定量，同时测定葡萄酒中的甲醇、异丁醇、异戊醇等物质含量[7]。

色谱条件：载气：高纯氮气99.999%，流速为1.0 mL/min；分流比：1∶35；尾吹：30 mL/min；高纯氢气：99.999%，流速为40 mL/min；空气：流量400 mL/min；检测器温度：230℃；进样口温度：210℃；柱温：初温35℃，保持5 min，以7℃/min的速率升至100℃，保持恒温2 min，再以10℃/min的速率升至150℃，保持恒温4 min。

相对较正因子（f值）的测定：待色谱仪基线稳定之后，吸取白酒混标溶液0.2 μL进样分析，记录白酒混标中各组分和内标的保留时间及峰面积，用其比值算出各物质的相对较正因子。

式中：f为各组分的相对较正因子；A2为混标中内标峰面积；A1为混标中各组分峰面积；M1为混标中各组分浓度(mg/L)；M2为混标中内标物浓度(mg/L)。

样品测定：准确称取内标物乙酸正丁酯1.0022 g，用60%色谱纯乙醇溶液定容至25 mL，取200 μL内标溶液，用蒸馏后的酒样定容到10 mL，混匀，样品中内标浓度为801.76 mg/L，与f值测定相同的条件下进样，进样量l μL。

式中：X为样品中各组分浓度，mg/L；A3为样品中各组分峰面积；A4为样品中内标峰面积；f为各组分的相对较正因子；C为样品中内标物浓度，mg/L。

1.3.7 香气成分

先将10.0 mL样品加入15 mL样品瓶中，加入2.5 g氯化钠，插入装有2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，60℃顶空萃取30 min。

实验谱图分析：对总离子流谱图进行Nist2005和Wiley275谱库检索，确定挥发性成分，并用峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。

1.3.8 感官评定

在室温20℃左右，湿度60%～70%之间，光线良好，干净通风无异味的室内。由7位具相关品评经验人员对蓝莓半甜红酒进行品评。包括观色（流动性，气泡，颜色，透明度，挂杯性）、闻香（果香，酒香）、品尝（酸，甜，苦涩，酒精，余味）、写评语、打分。每个评酒员按细则要求在给定分数内逐项打分，累计总分，再把每个评酒员的分数相加，取平均值为该酒的感官评定分数。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验（图3、图4、图5）

实验结果表明，Z2发酵蓝莓红酒的酒精度，随pH值的升高而升高，从pH2.9时的11.95%vol升高到pH4.1时的12.12%vol；酒精度随糖度的升高而升高，从糖度为16°Bx时的8.76%vol升高到糖度为28°Bx时的15.34%vol；酒精度随发酵温度的升高而降低，从19℃时的12.17%vol降低到31℃时的11.92%vol。

由图4可知，随pH值的升高，糖消耗量增加，发酵完成后总糖含量低，极有可能是由于在pH4.1、温度为31℃时接近酵母的最佳生存条件，酵母的生理活动比较旺盛，消耗更多的糖。发酵时的糖度越高，酵母在一定的发酵时间内未完成发酵，红酒中的总糖含量就比较高。

上述实验结果表明，发酵温度对蓝莓红酒中总酸的影响不大，随着温度的变化，总酸一直处于7.45～7.8 g/L的范围内。糖度为16°Bx时候的总酸约为6.5 g/L，可能是此时酒精度比较低，酸类物质未全溶解进入红酒内，当酒精度升高到一定的范围后，蓝莓红酒中总酸保持约7.5 g/L的稳定状态。pH值对蓝莓红酒的酸度影响比较大，在调整蓝莓果浆pH值时加入的CaCO3中和了蓝莓中的酒石酸形成了酒石酸盐沉淀，从而降低了蓝莓红酒中的总酸含量。

图3 单因素对蓝莓红酒酒精度的影响

图4 单因素对蓝莓红酒总糖的影响

图5 单因素对蓝莓红酒总酸的影响

单因素对蓝莓红酒色泽及酚类的影响见表2。由表2可看出，蓝莓红酒的发酵温度及糖度对色度的影响不大，色度随着pH值的升高而降低。单宁、总酚的变化情况显示出一致性，二者随着pH值的增大而增大，随着温度的升高而高。糖度对单宁及总酚的影响不大。

表2 单因素对蓝莓红酒色泽及酚类的影响

在蓝莓红酒中，花青素不是单独存在的，而是与糖结合在一起，以糖苷的形式存在。上述实验得出，发酵糖度对花色苷含量的影响不大（图6），不同糖度所发酵的不同酒精度的蓝莓红酒的花色苷含量均在255～265 mg/L的范围内，在pH2.9～3.5时，花色苷含量的变化不大，当pH值＞3.5后，花色苷含量明显随着pH值的升高而降低。温度为28℃时，发酵的蓝莓红酒的花色苷含量最高为281 mg/L，25℃时次之为278 mg/L，其余温度所发酵的蓝莓红酒的花色苷含量均为265 mg/L左右。

图6 单因素对蓝莓红酒花色苷的影响

图7 单因素对蓝莓红酒甲醇及杂醇油的影响

上述实验结果表明，蓝莓红酒中甲醇和杂醇油的量均随着温度和pH值的升高而升高，可能是在pH4.1与温度31℃时，果胶酶活性较强，酵母本身增殖及裂解活力比较强，由此产生较高的甲醇及杂醇油含量(图7)。甲醇含量随着糖度的升高有所降低，从糖度为16°Bx时的264 mg/L降低到糖度为28°Bx时的218 mg/L，可能是由于糖度高的果浆加糖量多，所含的果胶物质相对少，由此产生的甲醇少。杂醇油随着果浆中加入蔗糖量的增多而增多，可能可以采取分批加糖法或者改添加蔗糖为葡萄糖，但由于所产的杂醇油量最高未超过350 mg/L，没有超过毒害标准，所以本研究未做进一步实验。

实验得出，在以上条件范围内，不同发酵方法发酵的蓝莓红酒都具有红酒的典型性，其中，pH值对色泽的影响比较大，pH3.5时的红酒呈透明的深紫红色（偏红），在pH值＜3.5时，蓝莓红酒呈紫色，pH值变低，红酒的透明度变差。在pH值＞3.5时，pH值升高，红酒越显红褐色且泛蓝色，有失红酒的美感。发酵温度对蓝莓红酒的香气影响比较大，温度28℃时发酵的红酒香气最为协调；温度低时发酵的酒香味淡；温度31℃时发酵的蓝莓红酒果香味略差。糖度为22°Bx时，发酵的蓝莓红酒有比较和谐的酒香味与果香味，糖度低的蓝莓红酒酒精度低，味道苍白且酸涩味重，糖度高的酒精度太高，入口过于辛辣，有失柔和圆润性。综合，在单因素的感官评定最好的点附近取点进一步做正交实验，以确定蓝莓红酒的最佳发酵条件。

图8 单因素对蓝莓红酒感官评定的影响

2.2 正交实验

在蓝莓红酒发酵中，根据单因素结果，用pH值、温度、糖度进行正交分析，正交实验设计及分析结果如表3。

由实验得出，3个因素对蓝莓红酒感官的影响因素顺序为发酵温度＞pH值＞糖度，发酵条件最佳组合为A3B2C2（温度30℃，pH3.5，糖度22°Bx）。

表3 正交实验设计及结果

2.3 成品检测

2.3.1 成品蓝莓红酒的理化指标

对蓝莓果实、调整后蓝莓果浆、成品蓝莓红酒进行各项指标测定，结果见表4。

表4 蓝莓果实及蓝莓红酒基本指标的对比

按照正交实验获得的最佳条件（发酵温度30℃、pH值3.5、糖度22°Bx）进行蓝莓红酒发酵，其酒体含有较高的总酚和花色苷含量，单宁充足且颜色较深；通过感官评价得分85.00分，且色泽深紫红、酒体澄清透明有光泽，有较好的蓝莓果香和醇香，口感略有酸味，具有典型红酒风格。

2.3.2 4种酵母菌发酵红酒的香味成分分析

通过气相色谱检测，4个酵母BV818、Z2、71 B、D254分别发酵的蓝莓红酒气相色谱图，结果见图9。

图9 4个酵母发酵的蓝莓红酒气相色谱图

图9表明，气相物质依次为醛，甲醇，正丙醇，乙酸乙酯，异丁醇，乙缩醛，正丁醇，乙酸，异戊醇，丁酸乙酯，辛酸乙酯，异丁酸，丁酸，β-苯乙醇。BV818发酵的蓝莓红酒中共检测到12种微量成分，其中醛类物质2种，高级醇4种，酯类2种，酸类2种；Z2发酵的蓝莓红酒中共检测到10种微量成分；其中醛类物质1种，高级醇4种，酯类1种，酸类2种；71B发酵的蓝莓红酒中共检测到10种微量成分，其中醛类物质1种，高级醇4种，酯类1种，酸类2种；D254发酵的蓝莓红酒中共检测到13种微量成分，其中醛类物质2种，高级醇4种，酯类2种，酸类3种；其余的为甲醇和β-苯乙醇。

3 结论

综合上述测试及分析，蓝莓红酒中总酚、单宁和花色苷的含量随着温度和pH值的升高而升高。酒精度随着糖度与pH值的升高而升高，随着温度的升高而降低。甲醇和杂醇油含量随着温度与pH值的升高而升高，杂醇油随着糖度的升高而升高。总酸随着pH值的升高而减少，总糖随着糖度的升高而升高。pH值对蓝莓红酒的色泽与口感有很大影响，温度对香气有很大影响，糖度对香气与口感有很大影响。通过正交实验得出，发酵最佳条件为发酵温度30℃，pH3.5，糖度22°Bx。本研究及结果可为蓝莓红酒工业化生产提供理论依据，市场前景广阔。