高效液相色谱同时测定葡萄酒中12种酚含量的研究

田 超，侯红萍

（山西农业大学食品科学与工程学院山西太谷030801）

多酚类物质是葡萄酒的重要功能成分。其中的无色多酚类又可分为类黄酮、酚酸、芪类物质等物质。葡萄酒中多酚物质的保健作用，特别是白藜芦醇对心脑血管的保护作用日益突显并被消费者广泛接受[1]，因此葡萄酒中多酚含量也成为葡萄酒生产及市场关注的重要指标。目前葡萄酒中的多酚类检测仪器以高效液相色谱及高效液相色谱-质谱连用[2]为主。而高效液相色谱检测多酚类物质的方法，亦广泛应用于葡萄酒与健康、葡萄酒工艺[3]、酿酒葡萄栽培[4]等学术研究领域。

目前已有的高效液相色谱检测多酚方法的研究很多。但随着对白藜芦醇和白藜芦醇苷的研究，有报道表示白藜芦醇苷可作为整体被生物吸收利用[5]，独立完成某些保健功能。因此试验尝试建立一种包含白藜芦醇苷在内的葡萄酒多酚同时检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

Agilent U3000高效液相色谱仪（包括色谱泵，自动进样器，DAD-UV紫外检测仪），Scientific Thermo Hypersil Gold 250×4.6mm 5μm液相色谱柱。HPLC级标准品：儿茶素，没食子酸，杨梅素，香草酸，表儿茶素，阿魏酸，白藜芦醇苷，芦丁，白藜芦醇，槲皮素，山萘酚。HPLC级试剂：超纯水，乙腈，乙酸（38%，v/v）。

1.2 样品萃取

萃取采用以韩国民等方法[6]的一种改进方法：取葡萄酒样30 mL，加入30 mL乙酸乙酯，以摇床低速摇匀30 min萃取，共3次，合并有机相后置于薄膜旋转蒸发仪（40℃下）蒸发至干，后用2 mL乙腈溶解，经0.45 μm滤膜过滤，制成样品备用。

1.3 标准溶液的配制

取没食子酸等12种标准品各20 mg，溶于10 mL乙腈，并依梯度稀释至5～150 mg/L配制成标准溶液及混合标准溶液，所有样品使用前于-30℃温度条件下保存。

1.4 最佳检测波长

通过已有文献结合实际检测确定最佳紫外检测波长为280 nm。对咖啡酸的检测应使用320 nm。

1.5 色谱条件的确定

已有文献表示：葡萄酒中无色单体酚的检测多采用有机相+酸+水的流动相组合[7]，并采用梯度洗脱程序[8]。而白藜芦醇的检测，流动相大多为有机相（甲醇[9]或乙腈[10]）和水的混合配比。且流动相中的有机相-水，在一定比例下调整，对白藜芦醇出峰时间有较大影响，而对洗脱回收率影响不大[11]。

综合考虑，色谱条件采用：采取流动相A：水+乙酸4%（v/v），流动相B：乙腈的搭配方法。并设定进样量10 μL，柱温30 ℃，流速1.0 μL/min。

以已有的方法为基础[12]，结合白藜芦醇及白藜芦醇苷的检测需要，设置一种改进的梯度洗脱程序，见表1。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 各种物质保留时间的确定

分别对12种物质标准品单独进样，记录保留时间。再对混合标准溶液进样获得检测图谱如图1、图2，检查各峰并对比保留时间，各物质出峰清晰，分离度满意。

图1 在280 nm检测波长下12种单体酚标准品色谱图

图2 在320 nm检测波长下12种单体酚标准品色谱图

由图1、图2可知，香草酸在320 nm检测波长下无较强吸收，与孙翔宇等[12]研究结果相同。故使其可与保留时间相对接近的咖啡酸相区别。因此在以下分析中，咖啡酸采用320 nm波长检测通道的数据，其余物质使用280 nm波长检测通道下的数据。

2.2 各物质保留时间和标准曲线

对各个不同浓度梯度混合标样进样，建立标准曲线，结果如表2。12种单体酚含量与检测值之间线性关系良好，线性相关系数均大于0.999，符合检测需求。各单体酚最低检测线较低，能符合定量检测要求，灵敏度相对较高。

2.3 重复性测试

在上述液相色谱条件下，取同一标样连续进样6次，记录其保留时间（表3）和峰面积（表4）。

2.4 稳定性测试

取6个间隔时间不同的标准品进行进样检测，记录各物质检测峰面积，如表4。

经统计分析，各物质保留时间的RSD值均较小，远低于2%。标准品峰面积差值RSD均低于5%。液相色谱工作重复性、稳定性良好。

2.5 加标回收率

根据样品中不同物质含量不同，选择添加相应合适浓度的标样重复测量5次。依照公式计算加标回收率。结果如表5。

由表5可知，每种单体酚加标回收率均大于80%，大于检测可接受下限。RSD均小于5%，检测方法可行。

表2 单体酚的标准曲线

表3 各单体酚重复进样6次的保留时间

2.6 葡萄酒样品测定

葡萄酒酒样来自市售及酒庄赞助。葡萄采摘年份均为2010年。以上述色谱条件进行单体酚检测，每种酒样重复3次。葡萄酒酒样进样获得检测图谱如图3、图4，单体酚含量分析结果见表6。

表4 各单体酚重复进样6次的峰面积

表5 加标回收率

表6 山西省不同子产区葡萄酒单体酚含量

图3 在280 nm检测波长下葡萄酒样品色谱图

图4 在320 nm检测波长下葡萄酒样品色谱图

3 结论与展望

葡萄酒内的总酚及单体酚含量仍然是未来葡萄酒领域持续关注的重要问题。高效液相色谱在可溶性高沸点有机物分离检测上仍占据核心地位。通过本次试验，建立了一种基于4.6 mm色谱柱，280 nm和320 nm检测波长，以水、冰乙酸、乙腈为流动相的葡萄酒单体酚检测方法。并对该方法的分离度、重复性、稳定性，加标回收率等指标进行了考察，结果满意。以此检测方法对山西省不同地区几款葡萄酒进行了检测。使该检测方法可为葡萄酒类研究提供一种单体酚的快速检测方法。