产香枯草芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的应用

王 西，沈 毅，张亚东，王冬梅

(四川省古蔺郎酒厂有限公司，四川古蔺646500)

酱香型白酒是中国白酒的重要香型，采用“四高两长”“二九八七”的独特酿造技术，所酿造的白酒具有“酱香突出，幽雅细腻，酒体醇厚，回味悠长，空杯留香持久”的风格特点。随着人们物质生活水平的提高，对于白酒酿造技术以及白酒风味需求也越来越高，而白酒功能微生物的研究对提高白酒品质具有重要价值。芽孢杆菌，包括嗜热芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌等都有较强的水解淀粉和蛋白质的能力，是酱香型白酒的风味物生成和风格形成的重要菌类[1]。由于芽孢杆菌能够产生蛋白酶与淀粉酶，其水解原料形成丰富的前体环境，有利于风味物质的生成[2]。枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌科细菌，为革兰氏阳性嗜热杆菌，已经证实这类嗜热芽孢微生物能产乙偶姻[3-4]、四甲基吡嗪[5]和呋喃扭尔。酱香型白酒生产本质上是酿酒微生物代谢及所产酶催化各种酶促反应的过程，而“高温堆积”则为酱酒生产提供了各种复杂的微生物和酶，富集的主要是酵母，同时细菌、霉菌也明显增多[6]。酱香型三次酒产酒量一般能达到10%左右，属于“大回酒”高产酒时段，对整批酒质有着极其重要的作用。本研究利用从高温大曲中分离得到的枯草芽孢杆菌，制成菌粉分别添加至酱香型二次酒高温堆积前和入池发酵前的糟醅中，模拟酱香型白酒生产，入池发酵40 d，以提高三次酒的品质，同时考察不同添加方式、添加量对糟醅和酒质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌株：从LJ高温大曲中筛选的枯草芽孢杆菌G2017-12。

试剂及耗材：所用糟醅、高温大曲、稻壳均来源于四川省古蔺郎酒厂有限公司。豆粕粉（粉碎过60目筛）、玉米黄粉、K2HPO4等均为食品级。其他试剂均为国产分析纯。

仪器设备：StableFlex纤维头（50/30 μmDVB/Carboxen/PDMS）、57550-U手动萃取手柄，美国Supelco公司；7890A-5975C气相色谱质谱联用仪，安捷伦科技有限公司；1.5 t地上衡，苏州太恒称重设备有限公司；高精度电子分析天平，上海精科仪器有限公司；SCQ-2201系列超声波清洗机，上海声彦超声波仪器有限公司；TDL-50台式低速离心机，常州梅香仪器有限公司；FJG微生物培养罐（150 L），温江工大轻工机械有限公司；小型喷雾干燥机GG-6000Y，上海桂戈实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 功能微生物种子培养

将摇瓶培养过的枯草芽孢杆菌移至微生物培养罐扩大培养。准确称量豆粕粉10 kg、玉米黄粉2 kg、K2HPO41 kg、功能菌种2.5 kg和适量蒸馏水添加到灭菌后的培养罐（灭菌操作：通热蒸汽对罐体升温，当温度达120℃、压强0.11 MPa时保持温度和压力20 min），制成100 L的培养液[7-9]。

发酵条件：发酵温度（35±1）℃，通气量25～40m3/h，搅拌速度150～160 r/min，通过调节转速控制发酵过程的溶氧在20%以上，罐压0.02～0.04 MPa，发酵过程中pH值保持在6.5～7.5。培养时间约24 h，最适放罐时间为26～28 h[10-11]。制成的枯草芽孢杆菌培养液经喷雾干燥[12-14]成粉末备用。

1.2.2 酱香型二次酒高温堆积与入池发酵

酱香型二次酒开窖、取酒、摊晾、撒曲后，模拟酱香型白酒工艺进行高温堆积和入池发酵。将备好的枯草芽孢杆菌菌粉在高温堆积前分别按0.5‰、1‰、4‰、7‰、10‰的接种比例添加至700 kg（1甑）糟醅中（此为高温堆积前添加组，简称“堆积组”），以不接入功能菌粉的糟醅为空白对照（简称“空白组”），同时另取5个堆在堆积后、入池发酵前添加0.5‰、1‰、4‰、7‰、10‰的接种比例至700 kg糟醅作比较（此为入池发酵前添加组，简称“入池组”），其中菌粉采用适量36℃温水活化30 min后使用。操作同时进行，各组糟醅做标记，操作具体要求如下。

堆积前，将初始糟醅搅拌均匀，再分成若干小堆，每堆准确称量700 kg，单独起堆，根据要求分成“堆积组”“入池组”“空白组”，同时操作，糖化时间控制为5 d，并以单独一口窖池发酵，全过程模拟酱香型白酒生产；然后入池时将各组的每堆（700 kg）糟醅分别入池发酵，采用编织布隔离区分，并做好标记，用窖泥封窖，发酵时间为40 d。高温堆积前、入池时、发酵40 d后立即测定各组糟醅的水分、酸度、蛋白质和四甲基吡嗪含量。当发酵期满，开窖取醅，将“堆积组”“空白组”“入池组”分别上甑蒸馏，对蒸馏得到的酒样进行顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction）结合GC-MS分析，同时对各组酒样进行感官鉴定。

1.2.3 糟醅及酒样中香味物质测定[15-17]

本研究香味物质以特征香味物质四甲基吡嗪（2,3,5,6-tetramethyrazine,TTMP）为参考目标，采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合GC-MS分析糟醅和酒样中挥发性成分及吡嗪类物质的含量。

样品处理：取糟醅20 g，研磨充分后加入40 mL蒸馏水浸泡12 min，然后搅拌加超声波处理40 min，离心取上清液6 mL于15 mL萃取瓶中，加入2 g NaCl(酒样稀释10倍，则直接取6 mL于15 mL萃取瓶中，不加NaCl)。插入装有2 cm-50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在60℃左右顶空萃取45 min取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250℃)中，热解吸4 min进样。采用全扫描模式对酱香型三次酒酒样和糟醅中挥发性成分进行检测。

气相色谱条件：色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，弹性石英毛细管柱，柱温35℃(保持5 min)，以4℃/min升温至135℃，再以8℃/min升温至180℃保持5 min，运行时间43 min；汽化室温度250℃；载气为高纯氦(He)(99.999%)；柱前压7.62 psi，载气流速0.8 mL/min；分流进样，分流比为20∶1；溶剂延迟时间2 min。

质谱条件：电子电离源(electron ionization，EI)，离子源温度230℃，接口温度250℃。

定性定量方法：采用选择离子扫描模式对四甲基吡嗪的4个特征离子进行扫描。根据峰面积与含量成正比的关系，用GC-MS联用仪计算其峰面积对应的响应值，根据已建立的四甲基吡嗪响应值-浓度标准曲线，得到糟醅中四甲基吡嗪含量。

1.2.4 蛋白质、水分、酸度含量的测定

蛋白质测定参照国标GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中的方法测定[18]；水分测定参照国标GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的方法测定[19]；酸度测定参照国标GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》中方法测定[20]。

2 结果与分析

2.1 接种量与接种方式对糟醅理化指标的影响

本实验分别对“堆积组”“入池组”“空白组”高温堆积前、入池与出池时糟醅的理化指标（蛋白质含量、水分、酸度、四甲基吡嗪）进行了测定，详细结果见表1、图1、图2。

由表1可知，接种量对发酵后糟醅的水分、酸度影响不明显，“堆积组”糟醅出池后最高水分42.57%，而最低水分为42.23%，最高酸度0.93H+mmol/10 g，最低酸度 0.84H+mmol/10 g。同等添加量条件下，“堆积组”发酵后糟醅的蛋白质消耗量、四甲基吡嗪生成量比“入池组”多。“堆积组”糟醅中最高四甲基吡嗪含量为6.98 μg/g，而“入池组”只有6.02 μg/g。添加功能性微生物枯草芽孢杆菌在白酒糟醅中，其特征香味物质的提升强度跟其添加的方法有着密不可分的联系，添加菌粉在糟醅堆积前会使堆积过程中功能性微生物大量繁殖和代谢，生成香味物质和香味前体物质。

由图1可知，“堆积组”发酵后糟醅中残留蛋白质含量随接种菌粉的数量增加而总体呈下降趋势，从表1可知，在同样的菌粉添加量时，残留蛋白含量基本上低于“空白组”和“入池组”。蛋白质减少可能与加入的枯草芽孢杆菌自身生长消耗及代谢利用部分蛋白质将其转化成四甲基吡嗪等风味物质有关。研究发现，枯草芽孢杆菌产生的中性蛋白酶与其他微生物产生的蛋白酶协同作用，能降解复杂蛋白质，对提高出酒率及酒的品质有积极作用。

堆积前的糟醅中四甲基吡嗪含量较低，为0.02 μg/g。从图2可看出，“堆积组”出池后，最低的四甲基吡嗪含量为2.34 μg/g，当接种量达到4‰时，其四甲基吡嗪含量达到最高，为6.98 μg/g，是空白组1.53 μg/g的4.56倍。其次为7‰接种量的“堆积组”，含量为6.62 μg/g。因此选择接种量为4‰进行后续分析。

表1 不同接种量与接入方式的糟醅理化指标

图1 接种量对“堆积组”糟醅中蛋白质含量的影响

图2 接种量对“堆积组”糟醅中四甲基吡嗪含量的影响

2.2 酒样中香味成分的分析

将“空白组”（接种量为0）、“堆积组”（4‰）、“入池组”（4‰）的酒样进行GC-MS成分分析，具体参数见表2。

由表2可见，“空白组”酒样中共检到42种物质，醇类物质9种，酯类物质15种，醛类物质2种，酮类物质3种，酸类物质6种，酚类化合物2种，芳香族及杂环类化合物5种。其中乳酸乙酯、乙酸乙酯相对含量较高，吡嗪类及前体物质含量较低。

“堆积组”酒样中共检测出50种物质，醇类物质9种，酯类物质18种，醛类物质3种，酮类物质3种，酸类物质6种，酚类化合物3种，芳香族及杂环类化合物8种。含量最多的是乳酸乙酯，相对百分含量为1.635%，检测到酱香风味代表物质有糠醛、吡嗪和糠醇等，其中2，3，5，6-四甲基吡嗪相对百分含量为0.037%，是“空白组”的3.08倍，三甲基吡嗪为0.008%，而“空白组”未检测出。

“入池组”酒样中共检测出48种，醇类物质9种，酯类物质17种，醛类物质3种，酮类物质3种，酸类物质6种，酚类化合物3种，芳香族及杂环类化合物7种。其中2，3，5，6-四甲基吡嗪相对百分含量为0.024%，是“空白组”的2倍。

“堆积组”的酒样中检测出物质种类多于“入池组”“空白组”；“堆积组”中的四甲基吡嗪及前体物质3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）相对含量分别为0.037%、0.105%，比“空白组”“入池组”高；“堆积组”中正丙醇、正丁醇、异戊醇、正己醇等高级醇相对含量较“空白组”低。

2.3 接入功能菌后酒样感官分析

各组酒样分别送于专业的品酒师进行暗评，评价方法参照《郎酒酱香原酒质量验收标准》，各组酒品评结果详见表3。

表2 各组酒样挥发性成分GC-MS分析结果

由表3可以看出，“堆积组”的酒样香味、口感均优于“入池组”“空白组”的酒样。

表3 各组的酒样感官品评表

3 结论

从高温大曲中分离得到的枯草芽孢杆菌，通过小型培养罐扩大培养后，干燥成菌粉，模拟酱香白酒生产工艺进行应用实验。结果表明，不同接种量对糟醅存在影响，发现“堆积组”接种量为4‰时效果最佳，所得糟醅中四甲基吡嗪含量较高；接种方式上，堆积糖化前添加所产酒的香味物质种类、特征香味含量、酒体感官质量均优于入窖前添加。