高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的筛选及在清香型原酒生产中的应用研究

马美荣，周林艳，王德斌，刘小改，王小伟，艾金忠，张 坤

（北京红星股份有限公司，北京101400）

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），又名川芎嗪，天然存在于大豆食品、咖啡、乳制品中，具有一种特别的香味，在食品工业中广泛用作调味剂、香味剂。现代科学证明其具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等作用，在临床上对于治疗缺血性心脑血管疾病及慢性心衰、肾衰等具有良好的疗效[1-2]。

白酒中四甲基吡嗪在制曲、堆积发酵等过程均会在不同程度上有所产生，并通过蒸馏工序进入白酒中，在中国主要白酒种类中有很高的含量，是一种对人体健康有益的风味物质[2]。当前学术界认为四甲基吡嗪的产生方式有两种：第一种是通过糖和氨基酸发生美拉德反应[3]；第二种则是通过微生物合成，主要分为两步：①芽孢杆菌利用底物合成四甲基吡嗪的前体3-羟基丁酮；②3-羟基丁酮与氨反应生成四甲基吡嗪[4]。近年来，我国许多名优企业为提高白酒中四甲基吡嗪含量，开展了利用微生物产生四甲基吡嗪的研究[5-8]。

我国酱香型、芝麻香型白酒中四甲基吡嗪含量较高，而清香型白酒中的含量较低，红星二锅头白酒作为清香型白酒的重要代表，也是京味文化的典型代表之一，为了提升红星二锅头酒产品的品质，增加红星白酒健康因子含量，我们选育高产四甲基吡嗪功能微生物，为进一步生产应用奠定良好的菌种基础。筛选的菌种应用于二锅头白酒发酵，极大提升了原酒中四甲基吡嗪的含量，改善了原酒口感。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

大曲：北京红星股份有限公司和某厂提供。

试剂：四甲基吡嗪标准样，迪马公司；脱脂奶粉，市售；葡萄糖、牛肉膏、硫酸铵等化学试剂，购自化学试剂公司。

细菌平板培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化钠0.5%，琼脂2%，121℃灭菌20 min。

脱脂奶粉平板培养基：脱脂奶粉8%，葡萄糖0.1%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钠0.05%，琼脂粉2%，121℃灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖2.5%，蛋白胨1.5%，酵母膏0.5%，硫酸铵1%，磷酸二氢钾0.02%，121℃灭菌20 min。

仪器设备：气相色谱仪(HP6890)，配有NPD检测器，安捷伦公司；显微镜(BX51)，奥林巴斯公司；电子天平(LA230S)，赛多利斯公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大曲中芽孢杆菌的分离纯化

取大曲2 g，加入装有50 mL无菌水的小三角瓶中，富集1 d后，用水浴加热方法加热至80～90 ℃或煮沸保持20 min，冷却，稀释至10-3、10-4、10-5不同的浓度后，涂布平板，同时做平行样，35～37℃培养箱中培养，随时观察其生长情况，将形态不同的单菌落挑出，重新划线接至固体平板上，35～37℃下培养2 d，多次重复，直至分离纯化得到单菌落，再进行镜检，确认得到的微生物为不同的菌种且都为纯种。采用将得到的纯种菌株分别转接于装有10 mL无菌水的试管中，按照其分离时采用的加热温度及加热时间加热，后逐级稀释，选择 10-3、10-4、10-5稀释浓度涂布平板；同时做平行样，于35～37℃下恒温培养2 d。观察加热过的菌种是否能重新长出，如能顺利长出，则说明其为分离得到的芽孢类细菌；相反其未能长出，说明其是非预期的杂菌，弃掉。将分离到的目的菌种编号冷藏。

1.2.2 菌种初筛

将菌种点接在制作好的脱脂奶粉平板上，每皿可点接3～4个菌株，35～37℃培养24 h，观察菌落周围培养基是否已被分解而呈透明。比较每个菌种在平皿中形成的透明圈的大小及菌落大小，以判断其蛋白酶酶解能力的大小。

1.2.3 菌种复筛

将纯化的菌种接至蛋白胨牛肉膏液体培养基中，37℃、150 r/min振荡培养24 h，然后以10%的接种量接入发酵培养基中，37℃、150 r/min振荡培养120 h；取100 mL发酵液加入50 mL 95%vol的食用酒精，蒸馏得到100 mL蒸馏液，然后用气相色谱仪测定蒸馏液中四甲基吡嗪的含量。

1.2.4 四甲基吡嗪含量的测定

检测器为NPD检测器。

色谱柱条件：DM-FFAP（30 m×0.32 mm×1 μm）；分流比：10:1；进样器：230 ℃；检测器：310 ℃；程序升温：初始70℃，以10℃/min升温至230℃，保持10 min。

1.2.5 菌株的分子鉴定

利用16S rDNA法对目的菌株进行分子鉴定。通过测定DNA序列得出同源性，当16S rDNA序列同源性高于97%时，可以认为是属内的同种。

1.2.6 菌株的生产应用

目标试验菌株的生产应用按图1流程进行。

在摊晾后加曲的同时，加入培养好的功能菌麸曲，并加入5%～8%高温大曲，拌匀后进行堆积发酵，收堆温度30℃，使酒醅温度达到48℃以上，低于55℃时，堆积24～48 h后入缸发酵，入缸温度控制在30℃，功能菌麸曲加入量为4.0%。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的分离纯化

根据芽孢杆菌耐热耐高温的特点，大曲富集培养后对培养液高温加热，从中分离筛选芽孢杆菌，结果见表1。因为不同的菌种耐热能力不同，采用不同的加热温度分离芽孢杆菌。从表1可以看出，80～90℃分离得到的芽孢杆菌多；不同厂家大曲的芽孢杆菌种类差别也较大。

图1 试验生产流程图

表1 芽孢杆菌分离结果

2.2 菌种初筛

将分离到的芽孢杆菌点接到脱脂奶粉平板上，观察各菌的透明圈大小及菌落大小，测量透明圈的直径与菌落直径，并记录各自的R值，详见表2。

表2 分离菌的R值

菌株B-2、B-6、B-7、B-9透明圈菌落直径比R比较大，说明这些菌株分泌蛋白酶并分解蛋白质产生氨基酸的能力较强，可选为复筛的菌株。

2.3 菌种复筛

利用气相色谱法对发酵液中的四甲基吡嗪含量进行测定，标准品的色谱图及样品的色谱图分别见图2和图3，从图3可以看出，在选定的色谱条件下，四甲基吡嗪与其他物质分离良好，该方法可用于检测发酵液中的四甲基吡嗪。

图2 四甲基吡嗪标准品色谱图

图3 样品色谱图

将初筛得到的较优菌种接种到发酵培养基中进行复筛，发酵液四甲基吡嗪含量的结果见图4。从图4可知，所筛选的4株菌具有较高的四甲基吡嗪产量，其中B-2的产量最高，可达21.39 mg/L。结果表明，通过考察菌株蛋白酶活性对菌株进行初筛是可行的。

2.4 菌种分子鉴定

将4株高产TTMP的芽孢杆菌进行16S rDNA序列测定，进行序列同源性分析，确定B-2、B-9为枯草芽孢杆菌属（Bacillus subtilis），B-6、B-7为地衣芽孢杆菌属（Bacillus licheniformis）。

2.5 生产应用

选择B-2和B-7菌分别制作麸曲，用于大曲酒堆积发酵，从结果来看，在基酒风格基本不变的基础上，酒体中四甲基吡嗪含量有极大的提高。从感官品尝来看，试验酒样除具有大曲酒清香纯正、入口绵甜、香味协调的特点外，增加了原酒的绵柔度，提升了原酒的成熟度。大曲样品酒色谱分析结果见表3。

表3 大曲样品酒色谱分析结果 (mg/L)

图4 不同菌株四甲基吡嗪产量

3 结论

从大曲中分离筛选到具有高产四甲基吡嗪活性的芽孢杆菌，高产菌株应用于公司原酒生产，极大提高了原酒中四甲基吡嗪的含量。四甲基吡嗪含量高的调味酒应用于红星二锅头新产品的研发中，完善了红星二锅头酒产品的风格特点，使之清香纯正、馥郁幽雅，酒体丰满绵柔，圆润爽净，回味绵长，提升了红星二锅头白酒的品质。该研究提升了红星公司的核心竞争力。

功能菌的添加比例、菌种组合及组合比例等对酒体中四甲基吡嗪含量影响、对酒体的影响研究还不够深入，今后要加大研究力度，确定更合适的应用方案。