大曲曲药中脲酶功能菌的选育与应用

徐占成，徐姿静，唐清兰，刘孟华

（四川剑南春集团有限责任公司，四川绵竹618200）

脲酶（Urease，urea amidohydrolase，EC 3.5.），又称尿素氨基水解酶，存在于大多数细菌、曲霉和高等植物中。它是一种酰胺酶、能使有机物质分子中酶键水解。其作用专一性仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和碳酸。有部分微生物产生的酸性脲酶(acid urease)不同于植物中提取的中性、偏碱性脲酶，酸性脲酶能耐受酸性环境，在pH4.0～5.5的体系中仍具有活性[1]。

在国外，乳酸杆菌已经被用于生产脲酶制剂，有效减少了葡萄酒中尿素含量[2-6]。在国内，脲酶已经被用于降低黄酒中尿素含量。但是，酒用脲酶在我国尚未形成生产能力，目前所用的酶制剂均从国外进口[7]。例如，某公司购买日本生产的酒用酸性脲酶去除黄酒中的尿素，该酸性脲酶在绍兴黄酒中作用时间48 h左右，可有效除去黄酒中约80%的尿素[8]。

由于酒用酸性脲酶被作为食品添加剂直接添加到葡萄酒或者黄酒中，而报道的产脲酶菌株都是细菌，普遍从动物粪便（鸟粪、鼠粪、牛羊粪便）、农田土壤、污泥等中分离获得[9]，并且需要一系列复杂的酶纯化提取工艺才能获得高纯度的酶制剂，从而极大地增加了生产成本，也增加了大规模生产的难度。

随着国内对酸性酒用脲酶的需求量不断增加，迫切需要解决酒用脲酶在国内生产能力不足的现状，因此酒用脲酶的研究对我国酿酒业的发展，拓展国际市场等方面均有深远的意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

曲样：剑南春中温大曲曲药。

分离平板培养基(g/L)：蛋白胨10，葡萄糖18，氯化钠5，磷酸二氢钾2，琼脂20，尿素20，0.4%酚酞溶液3 mL，调pH7.0后分装于三角瓶，121℃灭菌20 min备用。

发酵培养基：麦芽汁，取大麦芽粉碎，加入4倍于麦芽质量的55～60℃的水，在55～60℃下保温3～4 h，过滤，煮沸，再次过滤，将麦芽汁浓度调整到5～70°Bx，分装200 mL/500 mL，115 ℃灭菌20 min备用。

仪器设备：紫外可见分光光度计cary50，美国瓦里安公司；酸度计Biorad C1000 PCR仪，美国Biorad公司；Wide mini sub电泳仪，美国Biorad公司；Biorad凝胶成像系统，美国Biorad公司；Biolog全自动微生物鉴定仪，美国Biolog公司；Thermo fisher高速冷冻离心机；美国Thermo fisher scientific公司；Minfors INFORS HT-5L发酵罐，瑞士INFORS公司；Biospec Minnibeadbeater细胞破碎仪。

1.2 试验方法

1.2.1 脲酶酶活性测定

将干燥的菌丝磨成粉状，参照邱业先等[10-11]的方法测定脲酶活性，取0.1 g菌丝，置于100 mL容量瓶中，加2 mL甲苯处理15 min，分别加入10%尿素10 mL和20 mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液,混合均匀。将容量瓶置于37℃下培养24 h，用38℃蒸馏水稀释至刻度，振荡并过滤。取滤液0.5 mL，加入4 mL苯酚钠（1.35 mol/L）溶液，并加入3 mL次氯酸钠（0.9%）溶液，仔细混匀显色20 min，最后用蒸馏水定容至50 mL。用Varian Cary 50 BiO型分光光度计，在578 nm处测光吸收值。根据标准曲线求出氨态氮含量。零空白不加入样品，其他操作与样品实验相同。对每一样品设置用水代替基质的对照。

酶活性定义：30℃，pH7.0条件下，1 g酶制剂1 min分解尿素产生氨的毫克数表示酶的活性U。

1.2.2 产脲酶菌株的分离、纯化

无菌条件下取10 g酒曲于装有90 mL无菌水并放有玻珠的250 mL三角瓶中，置揺床上室温振荡30 min。取菌液按10倍的梯度稀释到10-6，取各稀释度菌液1 mL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50℃的培养基，混匀，待凝固后放入30℃培养箱中培养2～5 d，按菌落周围是否变红进行初筛。

1.2.3 高产脲酶菌种的筛选

保存菌株接种到ME培养基上活化，30℃光照培养10 d，待其产孢子后，用无菌水洗下孢子，配制成浓度约为106个/mL的孢子悬液。然后将孢子悬液按照每瓶2 mL的接种量接种到脲酶发酵培养基中（200 mL/500 mL三角瓶）。在35℃条件下，180 r/min，发酵培养6 d。收集菌丝及液体，测定其脲酶活性。按其脲酶活力大小及菌株性能，筛选出高产脲酶的菌株。

1.2.4 菌种形态及生理生化鉴定

菌落形态观察，显微结构观察及生理生化指标的测定。

1.2.5 18S rDNA分子生物学法鉴定菌种

（1）DNA提取

收集菌体，溶于5 mL提取缓冲液（100 mM Tris·Cl，100 mM EDTA-2Na，200 mM NaCl，2%CTAB，pH8.0）中，37 ℃振荡45 min。加入0.75 mL 20%SDS，65 ℃水浴1 h。12000 r/min，离心10 min，收集上清液。上清液用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶4∶1）抽提 2次，加入终浓度 0.3 M 的 NaAC（pH5.2）及2倍体积的无水乙醇，室温沉淀1 h。4 ℃，12000 r/min，离心20 min，收集沉淀，用70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50 μL TE（10 mm Tris-HCl，1 mm EDTA-2Na，）中，即得总DNA。

（2）扩增18S rDNA

以总DNA为模板，真菌通用引物18SF（SEQ ID No.2：CCAACCTGGTTGA TCCTGCCAGTA）和18SR（SEQ ID No.3：CCTTGTTACGACTTCACCTT CCTCT）分别为正向引物和反向引物扩增18S rDNA。扩增反应体系为 50 μL：10×Buffer 5 μL，dNTP 1 μL，Taq 酶 0.5 μL（2 U），正反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 40.5 μL。扩增反应条件：94 ℃、4 min预变性；94℃、0.5 min，55 ℃、1 min，72℃、0.5 min，30个循环；72℃延伸7 min。

表1 初筛得到菌株的变红时间及颜色深浅

（3）18S rDNA序列分析

将扩增的18S rDNA片段送上海生工测序，通过美国国家生物技术信息中心的BLAST搜索程序进行比较，获得同源性比对分析结果。

1.2.6 脲酶制剂的制备

利用发酵罐生产脲酶制剂，选用发酵培养基对脲酶菌株进行发酵，发酵6 d后，收集菌丝体，用无菌水多次洗涤，然后低温冷冻干燥，4℃冷藏保存备用。干燥后的菌丝采用细胞破碎仪破碎与粉碎机粉碎后，测定脲酶活性，试验重复3次。

1.2.7 脲酶制剂在酿酒过程中的应用

（1）不同pH值对脲酶活性的影响

酿酒发酵过程中的pH值一般维持在3.5～4.5之间，因此研究pH值对其酶活性的影响对进一步的应用研究有指导意义。用乳酸和乳酸钠缓冲液调整不同pH值，用不同pH值乳酸和乳酸钠缓冲液代替柠檬酸缓冲液，测定脲酶制剂在不同pH值条件下的脲酶活性。

（2）脲酶制剂在酿酒中的应用

为了进一步研究酸性脲酶在酿酒中的应用，本研究购买市售黄酒实施了尿素去除率实验。将制成的脲酶制剂按照一定量加入上述酒样中，置于25℃条件下反应，每隔24 h测定尿素的含量[12]。

将JNC-U5菌株应用于中温大曲曲药生产，提高大曲的脲酶活性。将大曲应用于酿酒生产，去除生成EC的底物，确保白酒的食品安全性。

2 结果与分析

2.1 高产脲酶菌株的筛选

因为脲酶分解尿素产生氨使培养基呈碱性；酚酞遇碱变红，颜色的深浅初步表示了菌株产脲酶能力的大小，初筛结果见表1。

挑选菌落周围变红的22株单菌落保存，初筛得到的菌株经形态观察发现主要为霉菌和细菌。

将初筛的菌株进行复筛和遗传稳定性研究。经过多次转接后发现，绝大多数菌株产脲酶的能力逐渐丧失，结果见图1。经过多代筛选，最终选出1株产脲酶能力稳定的菌株JNC-U5，其产脲酶活力可达49.7 U/g，根据形态初步鉴定为霉菌。

图1 22株菌株的脲酶活性

2.2 形态及生理生化鉴定结果

将4℃保存的菌株用ME斜面培养基活化3 d，然后用接种针挑取斜面的菌落接种到ME平板培养基上，以28℃培养7 d，观察菌落形态，于显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态，用扫描电镜Quanta TM450FEG观察菌体的超微结构（图2）。

该曲霉菌落在ME培养基上呈辐射生长，有辐射形沟纹，28℃培养7 d，直径22～30 mm；颜色呈灰绿色，周围有白色的晕圈；菌落反面呈淡褐或暗褐色。分生孢子梗直接生于基质或生于气生菌丝，分生孢子为球形或近球形，孢子表面粗糙，有小刺；小分生孢子头呈疏松柱形或散乱。

图2 菌落形态及菌体超微结构

表2 JNC-U5菌株生理生化特征结果

生理生化鉴定采用Biolog微生物鉴定仪进行鉴定。将曲霉的孢子悬液接种到微生物鉴定板中，该鉴定板中含有各种碳、氮源及微量成分，以鉴定板的第一个小孔作为空白对照。在28℃条件下，培养48 h，然后用Biolog微生物鉴定仪，750 nm处测吸光值，得出的生理生化鉴定结果见表2。

生理生化鉴定结果与Biolog系统数据库比对，结果显示，筛选得到的产脲酶菌株JNC-U5为聚多曲霉。同时形态特征也与聚多曲霉形态特征相符。

2.3 18S rDNA分子生物学鉴定结果

以真菌18SF、18SR作为引物扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶鉴定，在1800～1900 bp之间，目的条带清晰（图3），引物特异性强，与预期结果一致。将PCR产物送上海生工测序，测序结果通过美国国家生物技术信息中心的BLAST搜索程序进行比较获得同源性分析结果（见表3）。

图3 JNC-U5 18S rDNA扩增产物电泳图

同源性分析结果表明，JNC-U5 18S rDNA基因序列与数据库中聚多曲霉(Aspergillus sydowii)基因序列覆盖度达99%，同源性达99%，因此认定JNC-U5菌株为聚多曲霉。

2.4 脲酶制剂的制备

JNC-U5脲酶产生菌株经过发酵培养基筛选、发酵条件的优化后，经5 L发酵罐发酵收集菌丝。菌丝低温冷冻干燥后采用细胞破碎仪破碎与粉碎机粉碎，其脲酶活性结果见表3。

表3 不同制备方法脲酶活性

两种不同的处理方式酶活基本相同（表3），但采用粉碎机粉碎操作简单，所以该脲酶制剂的制备选用粉碎机直接粉碎即可用于生产，极大地降低了生产成本，更适宜工业化大生产。该脲酶制备方法已获得国家发明专利，专利号：ZL201210531870.2。

2.5 脲酶制剂在酿酒过程中的应用

2.5.1 不同pH值对脲酶活性的影响

酿酒发酵过程中的pH值一般维持在3.5～4.5之间，因此本文研究了pH值对脲酶活性的影响，结果见图4。

图4 不同pH值对脲酶活性的影响

从图4可以看出，尽管随着pH值的降低，该酶的活性受到一定的抑制，但是在pH3.5～4.5之间时仍然保持较高的活性。即说明JNC-U5菌株制备的脲酶制剂可用于酿酒生产。

2.5.2 脲酶制剂在酿酒中的应用

将脲酶制剂按照一定量加入市售黄酒样中，置于25℃条件下反应，每隔24 h测定尿素的含量。测定结果（图5）表明，添加脲酶制剂后24 h，尿素去除率可以达到78.5%，此后尿素去除率变化不大，48 h后尿素去除率超过80%。

图5 尿素去除率

将JNC-U5菌株应用于中温大曲的生产，大曲各项理化性能结果如表4，糖化力提高了11.5%，液化力提高了9.7%，脲酶活力得到显著提高，提高了141%。该曲药应用于酿酒生产，能有效去除生成EC的底物，大幅降低EC含量，确保了白酒食品安全性。

表4 大曲理化性能结果

3 讨论

本研究筛选到1株产脲酶性能稳定的菌株JNC-U5，该菌经形态、生理生化及分子生物学鉴定定性为聚多曲霉。该菌产脲酶活性为69.3 U/g，为脲酶的生产提供了宝贵的菌株资源。该菌种所产酶制剂在pH3.5～4.5环境下仍保持较高活性，在复杂的黄酒体系中仍能保持活性，24 h尿素去除率高达78.5%，48 h尿素去除率超过80%，说明其在酒类尤其是黄酒酿造中具有极大的应用价值。

产脲酶菌株JNC-U5应用于中温大曲的生产，大曲糖化力提高了11.5%，液化力提高了9.7%，脲酶活力提高了141%。该大曲应用于酿酒生产，能有效去除生成EC的底物，大幅降低EC含量，确保了白酒的食品安全性。同时，JNC-U5菌株的筛选成功也为生产酒用脲酶制剂提供了新的选择，具有极大的应用和推广价值。