高效液相色谱法快速检测麸曲中乙偶姻

刘学彬，古明亮，汪 平，周榆林，罗爱民

(1.四川茂华食品有限公司，四川眉山620010；2.四川大学轻纺与食品学院食品工程系，四川成都610000)

乙偶姻又名3-羟基-2-丁酮或甲基乙酰甲醇，化学式CH3CH(OH)COCH3，乙偶姻长期以来是一种重要的食用香料，天然存在于奶油、可可、葡萄酒和草莓中[1]，具有明显的让人欢愉的奶油香味，广泛应用于食用香精香料中。四甲基吡嗪作为中国白酒中健康的风味成分，其来源得到了极大的关注[2]，研究显示其具有抑制血小板集聚、保护心脑血管、保肝护肝等临床药理作用，赋予了中国白酒保健功能[3]。研究表明，乙偶姻是传统发酵食品重要香气成分四甲基吡嗪生物合成的前体物质，是多种微生物糖代谢的中间产物[4-5]。朱兵峰等[6]以获得高产四甲基吡嗪菌株为目标,建立了一种内源前体乙偶姻筛选策略,从酱香型高温大曲中获得1株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌，丰富了制曲理论，为提高白酒中四甲基吡嗪含量的研究奠定了理论基础。故研究提升酒曲中乙偶姻含量，对提升白酒质量有着重要意义，这就需要建立一种快速检测乙偶姻的方法。

目前关于检测乙偶姻方面的文献报道很少，福建农林大学陈继承等[7]采用高效液相色谱法同时测定了醋中乙偶姻和四甲基吡嗪的含量,并表明两者存在的显著正相关性。Zeppa等[8]采用高效液相色谱法对奶酪中的乙偶姻进行了检测，除此以外对乙偶姻的检测目前报道大多集中在气相色谱或者气质联用方法[9-12]，大多存在准确性较差，样品处理繁琐复杂等缺点。本研究首次采用高效液相色谱法检测麸曲中乙偶姻，具有样品前处理简单，对操作人员要求不高，方法准确性高、重复性好、便于推广等优势，并在此基础上对不同麸曲样品进行了检测。丰富了制曲理论，为筛选高产乙偶姻菌株，检测酒曲中乙偶姻含量，进而提高白酒中四甲基吡嗪含量，提升酒质等多方面奠定了一定检测理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

麸曲：由实验室筛选得到的纯种细菌接种制成。

试剂：乙偶姻标准品购自Aladdin试剂公司，甲醇（色谱级），无水氯化钙，三氟乙酸，乙醇，无水氯化钙，本实验中应用的生化试剂均为分析纯及以上级别，溶液由蒸馏水配制。

仪器设备：Agilent 1200高效液相色谱仪，带自动进样器、紫外检测器、色谱工作站，Phenomenex Gemini 5 μ C18110A(250×4.60 mm)色谱柱；JA12分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；YM-1000CT恒温超声仪（上海豫明仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理方法

在电子天平上精确称取25 g麸曲样品、0.25 g无水氯化钙于100 mL三角瓶中，加50 mL 57%vol乙醇，置于恒温超声仪中超声提取20 min，4000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜过滤，完成样品制备供HPLC分析用。

1.2.2 色谱条件

采用Agilent 1200系列高效液相色谱仪，Phenomenex Gemini 5 μ C18110A(250×4.60 mm)色谱柱。色谱条件为：采用C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相比例为甲醇∶水（加0.05%三氟乙酸）=5∶5；检测波长为278 nm；柱温35℃；流速为0.8 mL/min，梯度洗脱；进样量20 μL。

1.2.3 乙偶姻标准曲线绘制

用电子天平准确称取约500 mg乙偶姻标准品，溶于25 mL 57%乙醇中，摇匀，定容至刻度，配制成20 mg/mL的乙偶姻标准品溶液。依次移取20 mg/mL的乙偶姻标准样品溶液稀释配制成浓度为0.5 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的系列标准溶液。乙偶姻系列标准溶液在选定的色谱条件下测定，以浓度为纵坐标、峰面积为横坐标，绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的确定

通过查阅文献[13-14]和对乙偶姻进行全波长扫描，综合考虑目标样品的检测灵敏度和响应值，最终选取278 nm作为检测波长。选用甲醇作为流动相，为了获得较好的分离效果，需要对流动相体系进行优化，反相色谱中通常在流动相中添加适量极性调整剂以达到减少谱带拖尾、改善峰形的效果，陈继承等[7]选择在流动相中加入1%醋酸和0.05%三氟乙酸，有利于酸化后川芎嗪的稳定性，达到改善色谱效果的作用。通过试验发现，本法在流动相中加入0.05%三氟乙酸可明显改善峰形，减少谱带拖尾，优化色谱效果。选用不同浓度甲醇经过多次实验，综合了灵敏度、分离度与保留时间3项指标，确定流动相中甲醇的最佳浓度为50%，标准样品保留时间约为4.1 min，可快速检测麸曲中乙偶姻。在此基础上考察不同柱温对色谱效果的影响，确定最佳柱温为35℃，此条件下峰形最佳，色谱效果较好。综合以上各种因素，最终确定色谱条件为：采用C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相比例为甲醇∶水（加0.05%的三氟乙酸）=5∶5；检测波长为278 nm；柱温35℃；流速为0.8 mL/min。麸曲样品经乙醇提取，过0.22 μm滤膜直接进样。基于该条件检测乙偶姻标准品溶液色谱图见图1。

2.2 标准曲线，检出限和定量限

图1 乙偶姻标准品溶液色谱图

基于以上确定的色谱条件对配制好的不同浓度乙偶姻溶液进行含量测定，得到不同浓度乙偶姻的色谱峰图，以浓度(单位mg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图2。其线性方程为y=498.89x-70.863，相关系数为R2=0.9997，结果表明，对照品在0.5～2 mg/mL范围内线性良好。将对照品稀释成不同浓度进行色谱分析以确定本方法的检出限，以3倍信噪比（S/N=3）计算该方法的检出限的为6.78 μg/mL。以10倍信噪比为标准，计算其定量限的为22.6 μg/mL。

图2 乙偶姻标准曲线图

2.3 稳定性试验

取麸曲样品，通过上述样品处理方法处理，分别放置0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，基于以上色谱条件精确吸取进样，记录所测样品峰面积。数据结果见表1。结果表明，麸曲样品在10 h内稳定。

表1 稳定性试验

2.4 精密度试验

将同一待测样品按上述色谱条件连续重复6次进样，记录乙偶姻峰面积。计算表明乙偶姻峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.67%，结果表明（表2），本方法准确性较好，可用于麸曲中乙偶姻的快速检测。

表2 精密度试验

2.5 加样回收率试验

取同一样品，采用样品加标方法测定计算回收率，具体结果见表3。由表3可知，乙偶姻加标回收率为96.00%～102.25%之间，平均加标回收率为99.25%，RSD为2.07%。表明本方法准确性较高，适用于麸曲中乙偶姻的快速检测。

2.6 不同样品乙偶姻含量检测

将本实验室筛选得到的12株产乙偶姻菌株纯种接种制成的麸曲样品，按1.2方法进行样品处理，基于本文建立的高效液相色谱检测条件上机检测样品乙偶姻含量，检测结果见表4。

表3 加样回收率试验

表4 不同样品乙偶姻含量检测

结果表明，由不同菌株纯种接种制成的麸曲均含有乙偶姻，不同样品乙偶姻浓度存在一定的差异，供试样品乙偶姻浓度分布范围为0.67～15.56 mg/mL，其中编号为12的供试样品乙偶姻含量较高，为15.56 mg/mL。

3 结论

基于高效液相色谱技术，本研究建立了一种快速检测麸曲中乙偶姻的方法，本方法采用溶剂体系辅助超声提取对麸曲样品预处理，操作简便。检测色谱条件为：采用C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相比例为甲醇∶水（加0.05%的三氟乙酸）=5∶5；检测波长为278 nm；柱温35℃；流速为0.8 mL/min，保留时间4 min左右。本方法线性范围为0.5～2 mg/mL，线性相关系数R2=0.9997，加样回收率试验表明，乙偶姻回收率在96.00%～102.25%之间，平均加标回收率为99.25%，相对标准偏差为2.07%，结合稳定性试验和精密度试验结果，表明本方法具有较好的精密度和重复性。与气相色谱法相比，本方法具有样品处理简单，对实验操作人员要求低、操作简便、检测成本低的优势，适用于白酒生产。

通过对不同菌株纯种制成的12个样品进行检测，表明不同菌株之间乙偶姻产量存在很大差异，也表明菌株不同对乙偶姻产量有很大影响，故本方法也为筛选高产乙偶姻菌株奠定了一定的检测方法基础。