气相色谱-稳定同位素质谱分析酱香型白酒中乙醇的稳定碳同位素比值

陈 航，沈保华，张素静，向 平，卓先义，沈 敏

（司法鉴定科学研究院，上海市法医学重点实验室，上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海200063）

白酒是世界七大蒸馏酒之一，在国内外享有盛誉[1]。贵州省茅台镇，是酱香型白酒的发源地和第一酒镇，也是国酒茅台的故乡[2]，其出产的酱香型白酒富含深厚的文化底蕴和极高的经济价值。伴随着个别人群对不法利益的索求，假酒时有出现，扰乱社会经济秩序，甚至危害人民生命安全，白酒的真伪和掺假鉴别越来越受到研究人员和监测机构的重视。随着科学技术手段的发展，傅立叶变换红外光谱[3]、电感耦合等离子体质谱[4]、控温水平衰减全反射-红外光谱[5]等谱学技术在白酒真伪和掺假鉴别中的研究逐渐深入。本研究团队曾利用气相色谱-质谱技术，建立了部分品类酱香型白酒的指纹图谱，确证了酱香型白酒中35种特征组分，形成了基于相似度计算的数学鉴别模型[6]。

稳定碳同位素比值（Delta C-13 value，δ13C）是一类物质本身的天然特征值，其可以反映出物质本身的来源等特征，近年来逐渐被各研究领域所重视和挖掘。2002年，我国以δ13C值为基础，建立了蜂蜜掺假检测的国家标准（GB/T 18932.1—2002），说明了δ13C值在食品真伪和掺假鉴别中的独特地位。在酒类真伪和掺假鉴别中，δ13C值的应用价值也正被全球范围内的专家学者所重视[7-9]，例如意大利、法国和德国联合建立了葡萄酒中乙醇δ13C值的数据库[10]。在我国，对酒中乙醇δ13C值分析和应用的重视正与国际保持一致。今年7月《出口葡萄酒中乙醇稳定碳同位素比值的测定》标准（SN/T 4675.3—2016）开始实施正是一个标志。

气相色谱-稳定同位素质谱（Gas chromatography-Isotope ratio mass spectrometry，GC-IRMS）在分析低沸点物质方面具有独特的优势。气相色谱能减少复杂的样品处理对分析结果产生的干扰和影响[11]，还能避免外来杂质的引入[12]，保证乙醇分析的高专属性。在国外针对葡萄酒原产地溯源、真伪和掺假鉴别的研究中，也大多采用气相色谱-稳定同位素质谱技术[13]。

本研究借鉴葡萄酒中乙醇的δ13C值分析方法，对33瓶产自贵州省茅台镇某酒厂不同批次的酱香型白酒、13瓶该酒厂生产的其他系列白酒、17种由非茅台镇地区酒厂生产的白酒、2种工业酒精进行分析，考察酒中乙醇的δ13C值在酱香型白酒真伪和掺假鉴别中的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Trace GC Ultra气相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；MAT 253稳定同位素质谱仪（美国Thermo Fisher公司，德国），配备GC Isolink接口；HP INNOWAX气相色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美国Agilent公司）。

酒中乙醇的稳定碳同位素标准物质为BCR-660（欧洲标准物质中心，δ13C=-26.72‰，不确定度=0.09‰）；乙醇（色谱纯，美国Fisher公司）；乙腈（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；去离子水由Milli-Q净化系统（Millipore公司，美国）制得。

1.2 样品准备

样品：购买自超市和网络商店的63瓶白酒（表1），其中产自贵州省茅台镇某酒厂不同批次的酱香型白酒33瓶（样品1～33，分为A组），该酒厂生产的其他系列白酒13瓶（样品34～46，分为B组），非茅台镇地区酒厂生产的代表性白酒共17种（每种1瓶，样品47～63，分为C组）；工业酒精2种（各1瓶，样品64、65，分为D组）。

分别按BCR-660和白酒标注酒精度，以乙腈∶水混合溶液（V∶V=1∶2）稀释至乙醇质量浓度约为4.0 mg/mL，混匀密封，低温保存待测。

1.3 仪器条件

进样量2 μL，进样口温度200℃，载气为高纯He。程序升温条件：起始温度45℃，保留3 min，以1℃/min速率升温至52℃，以20℃/min的速率升温至200℃，保留2 min。燃烧管温度为1020℃，切入质谱时间90 s。CO2参考气在30 s，850 s和900 s分别切入20 s。切入反冲氦气时间800 s。

1.4 数据分析

Isodat 3.0（美国Thermo Fisher公司）软件用于数据获取和同位素值计算。SPSS 19.0（美国IBM公司）软件用于数据统计分析。

1.5 方法学考察

对方法进行专属性、精密度和准确度考察。分别分析色谱纯乙醇、色谱纯乙腈和去离子水，观察乙醇保留时间范围内是否存在干扰峰，考察方法专属性。7天内重复分析BCR-660样品，每天连续测定3次，以7天×3次样品分析值的变异系数（Coefficient of variation，CV）描述方法精密度，以7 d×3次样品分析值与证书标定值的偏倚（Bias）描述方法准确度。

2 结果与讨论

2.1 专属性和保留时间

分别分析色谱纯乙醇、色谱纯乙腈、去离子水，色谱纯乙醇在约440 s出现色谱峰，色谱纯乙腈在约590 s出现色谱峰，去离子水在方法运行时间内不出现色谱峰（图1）。

图1 乙醇（A）、乙腈（B）、水（C）的GC-IRMS分析图谱

GC Isolink接口中的燃烧管会将所有由气相色谱通向同位素质谱的含碳有机物转化成为CO2气体，对GC-IRMS方法提出了较高的专属性要求。HP INNOWAX色谱柱以聚乙二醇(PEG)为固定相，使其拥有强极性和较高使用温度上限的特殊优势，适宜分析以高极性物质为溶剂的低沸点挥发性物质。在本研究中，经处理的样品中，除乙醇外含量最高的含碳的物质（乙腈）不对乙醇分析产生干扰。白酒中其他低沸点的含碳风味成分含量与乙醇相比较低[14]，在IRMS中不产生信号。方法专属性适合于白酒样品的分析。

2.2 精密度和准确度

连续7 d分析BCR-660（δ13C=-26.72 ‰），测量值分布在-27.20‰至-26.69‰范围内，测量值的CV值小于0.76%，与证书标定值间的Bias值小于1.80%。本研究所用方法最大程度上简化了样品处理过程，避免了样品处理带来的同位素分馏。采用了酒类样品分析中不影响乙醇分析精度的乙腈作为稀释剂[15]，将样品中乙醇的碳浓度降低，使IRMS的电信号强度控制在3000至10000 mV这一能得到乙醇较真实的δ13C值的范围内[12]。方法的精密度和准确度均符合分析要求。

2.3 白酒样品分析

根据上述方法，对本研究中全部65个样品进行分析（表1）。

本研究测试的33个产自贵州省茅台镇某酒厂不同批次的酱香型白酒样品（即A组样品）中，乙醇的δ13C值分布在-19.53‰至-19.11‰之间。根据李鑫等研究者的模拟发酵研究[16]，该值接近由纯高粱发酵所获得乙醇的δ13C值（-18.9‰至-16.3‰），与该品类酒所标示的主要发酵原料相符。33个样品间的标准偏差（Standard Deviation，Std Dev）为0.12‰，小于方法精度，说明所分析的33个A组样品乙醇来源（即发酵原料）、乙醇生成过程（即发酵过程）相同。

该酒厂生产的其他系列白酒（即B组）样品中乙醇的δ13C值分布在-17.70‰至-14.41‰之间，与A组白酒样品相比，A组白酒样品的δ13C值更加贫化（图2）。非茅台镇地区酒厂所生产白酒（即C组）样品中乙醇的δ13C值分布在-30.35‰至-15.22‰之间（图2）。2个工业酒精（即D组）样品中乙醇的δ13C值分别为-11.60‰和-13.66‰（图2），与文献报道值处于同一水平[16]。

通过依次对本次分析中B组、C组和D组样品中乙醇的δ13C值对A组白酒样品做单样本t检验，均呈显著性差异（P＜0.01）。其中，D组样品与其他3组样品间存在非常明显的差异。这一数据揭示了稳定碳同位素分析技术在鉴别酱香型白酒真假，尤其是辨别工业酒精勾兑的假白酒中可能具有巨大的应用潜力。

分别以不同香型和酒精度对本研究中63个白酒样品进行分组（图3），并依次进行组间t检验，均无显著性差异（P＞0.05）。白酒香型主要由其中非乙醇的风味物质决定[17-18]，不影响白酒中乙醇的δ13C值。不同白酒酒精度差异可能来源于发酵过程，其与成品白酒中乙醇的δ13C值间的关系需要进一步研究。

表1 酱香型白酒样品及工业酒精中乙醇的δ13C值

图2 各组白酒及工业酒精样品中乙醇δ13C值的点状图

单一生产原料的白酒中乙醇的δ13C值与文献报道相符。主要生产原料为大米的白酒种类（53号样品（δ13C=-31.35‰）、54号样品（δ13C=-29.01 ‰）和56号样品（δ13C=-30.08‰）），其δ13C值贫化程度高，与模拟发酵研究中大米发酵所得乙醇的δ13C值（-30.3‰至-27.9‰）[16]相近；主要生产原料为高粱的白酒种类（52号样品，δ13C=-16.13‰；61号样品，δ13C=-17.83‰），δ13C值与模拟发酵研究中纯高粱发酵所获得乙醇的δ13C值（-18.9‰至-16.3‰）[16]相近。通过单一生产原料白酒的δ13C值分析，说明乙醇的δ13C值能较为准确的还原其发酵原料信息，在单一生产原料白酒的掺假鉴别中具有应用潜力。

多生产原料白酒中乙醇δ13C值的特征性仍需更深入的研究。多数白酒出于口感等多因素的考虑，常使用两种以上生产原料，如某酱香型白酒使用小麦、大米、玉米、高粱、糯米5种粮食为主要发酵原料，其中大米、小麦的δ13C值富集，玉米的δ13C值贫化，在不清楚酒厂使用各原料配比的基础上，难以简单的从单次分析得到的δ13C值数据中提取出与生产原料间的相关特征。

图3 不同香型（A）和不同酒精度（B）白酒样品中乙醇δ13C值的点状图

3 结论

GC-IRMS分析方法可以获得白酒中乙醇的δ13C值，方法专属性强、精密度和准确度均能满足分析需求。同一酒厂出产的同系列不同批次酱香型白酒中乙醇具有相对稳定的δ13C值，且与文献报道的由其标示发酵原料所得乙醇的δ13C值相近，符合其工艺特征。同一酒厂出产的同系列不同批次酱香型白酒中乙醇的δ13C值与其他系列白酒样品、其他酒厂白酒样品、工业酒精样品均存在显著性差异。单一生产原料的白酒中乙醇的δ13C值还与其发酵原料具有较强的对应关系。稳定碳同位素比值分析技术在白酒真伪和掺假鉴别中具有巨大的应用潜力。