不同酵母菌株酿造橘子酒香气比较

陈清婵，简清梅，李 蓉，孙爱红

（荆楚理工学院，生物工程学院，湖北荆门 448000）

以柑橘为原料酿造果酒，酒精度低，酒质温和爽口，果香味浓，基本保持了柑橘中的天然营养成分。湖北是柑橘生产区之一，柑橘业已成为湖北省农业生产的支柱产业。因此充分利用湖北省的柑橘资源，酿造具有本地柑橘特色的果酒，为柑橘产业的发展开辟了一条新的道路。柑橘酒的香气和味道对柑橘酒的品质起着很大的作用，也是评价柑橘酒品质的重要感官指标。然而，柑橘酒的香气和呈味并非是单一化合物的作用。酒中含有多种香气物质，主要包括醇类、醛类、酮类、酯类等，这些物质的浓度从每升几毫克到每升几百毫克，正是这些物质相互作用形成了酒的特征香气。特征呈味是由多种呈味物质，如有机酸、氨基酸、酚酸、单宁酸、糖类等物质相互作用的结果，这些滋味物质一部分来源于橘子本身，另一部分来源于发酵过程和陈酿老化阶段。

目前，鉴定果酒中香气、呈味物质方法主要包括GC-MS法、GC-O法、顶空固相微萃取法、液液萃取法等。汪立平等[1]以顶空固相微萃取法和气相色谱质谱联用，研究了苹果酒香气的快速提取方法。温海祥、江东文等[2]利用液-液萃取法提取香蕉果酒中的挥发性香气成分，用气相色谱-质谱(GC-MS)技术进行分析。董曼、任婧楠等[3]研究了自然发酵和接种发酵树莓酒中的香气物质,并对其进行感官分析，运用GC-O检测法确定特征香气活性物质。

本试验通过对从橘子果实上分离筛选出的天然野生优良菌株和优选的商业果酒酵母所酿造橘子酒的生香性能进行比较研究，确定柑橘果酒的香气组成及不同酿酒酵母对柑橘果酒香气成分的影响。初步探讨适合酿造柑橘果酒的酵母菌，为橘子酒生产菌种的选择提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料与试剂：橘子，荆门本地产；白砂糖，武汉广盛元食品有限公司；法国葡萄酒专用酵母FX10、安琪果酒酵母、高温酿酒酵母，烟台帝伯仕自酿机有限公司；酵母菌JZ-1和JZ-2，实验室筛选得到；亚硫酸（分析纯），天津市东丽区天大化学试剂厂。

仪器设备：固相微萃取(SPME)装置、手动固相微萃取进样器、二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)50/30 μm、20 mL顶空钳口样品瓶，美国 Supelco公司；Agilent 6890N/5975MSD气质联用(GC-MS)仪，美国Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 橘子酒酿造工艺

橘子→去皮→打浆→过滤→橘子清汁→调糖→调SO2浓度→接种→发酵。

调糖：用白砂糖调整橘子汁糖度为20°Bx。调SO2：用亚硫酸调整SO2浓度为100 mg/L。

斜面酵母菌株的活化：用接种环取1环保存的斜面酵母转接到PDA斜面培养基上，培养箱中28℃培养24～48 h，至酵母长满斜面。

干酵母的活化：称取0.02 g干酵母，置于调好的100 mL橘子清汁中，于30℃水浴锅水浴活化15 min。

菌种扩大培养：从活化斜面培养基上取1环活化菌种接入50 mL经灭菌处理的橘子清汁中，28℃摇床培养24 h，振荡速度120 r/min。

接种：分别将各菌株扩大培养液按5%的体积比例接入到100 mL橘子清汁中。

发酵：放入25℃培养箱中恒温发酵，发酵时间为7 d。

1.2.2 固相微萃取(SPME)法质谱条件

取10 mL样品置于20 mL钳口瓶中，用聚四氟乙烯隔垫密封，于磁力搅拌器上在60℃加热平衡15 min后，通过隔垫插入已活化好的SPME萃取头(270℃活化30 min)，推出纤维头，顶空吸附40 min后，插入GC进样口解析5 min。

色谱条件：色谱柱为DB-5 MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气：氦气；柱流量：1 mL/min；进样口温度：250℃，不分流进样；起始温度40℃，保持3 min，以3℃/min升至160℃，再以8℃/min升至220℃，保持3 min。

质谱条件：接口温度280℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；离子化方式：EI；电子能量70 eV；质量范围35～350 amu/s。

1.2.3 化合物鉴定及定量

定性分析：样品挥发性化合物经气相色谱分离，不同组分形成其各自的色谱峰，用气相色谱-质谱-计算机联用仪进行分析鉴定。分析结果运用计算机谱库(NIST/WILEY)进行初步检索及资料分析，再结合文献进行人工谱图解析，确认挥发性化合物的各个化学成分。以归一法计算各香气物质的峰面积，作为各香气成分的相对含量。根据香气物质种类及含量比较各菌株的生香性能。

2 结果与分析

2.1 5种酵母菌酿造的橘子酒香气组分

5种酵母酿造的橘子酒通过HS-SPME法分析后，所检测的挥发性成分差异比较明显。GC-MS鉴定出的橘子酒中挥发性成分及其相对质量分数见表1。

由表1可知，5种酵母菌发酵橘子酒的香气成分经GC-MS分析后，共检出香气成分38种，共6类化合物。安琪果酒酵母发酵橘子酒中检出酯类12种，醇类4种，烯类12种，醛类2种，杂环类1种，酚类1种，共32种化合物。FX 10酵母发酵橘子酒中检出酯类12种，醇类1种，烯类12种，醛类1种，酚类1种，共27种化合物。高温酿酒酵母发酵橘子酒中检出酯类8种，醇类1种，烯类12种，酚类1种，共22种化合物。JZ-1酵母发酵橘子酒中检出酯类11种，醇类2种，烯类11种，酚类1种，共25种化合物。JZ-2酵母发酵橘子酒中检出酯类9种，醇类1种，烯类10种，醛类1种，酚类1种，共22种化合物。安琪果酒酵母发酵橘子酒检出物质中相对质量分数较高的是1-戊醇（29.11%）、辛酸乙酯（21.72%）、乙酸异戊酯（9.1%）、苯乙醇（9.06%）、癸酸乙酯（8.36%）、正己酸乙酯（3.2%）、D-柠檬烯（3.88%）、乙酸苯乙酯（2.88%）；FX 10酵母发酵橘子酒中检出的物质中相对质量分数较高的有甲酸异戊酯（21.73%）、乙酸异戊酯（5.63%）、辛酸乙酯（15.45%）、乙酸苯乙酯（2.98%）、癸酸乙酯（8.22%）、苯乙醇（12.69%）、D-柠檬烯（3.82%）、3-蒈烯（14.04%）、(+)-枞油烯（2.8%）；高温酿酒酵母发酵橘子酒中检出的物质中相对质量分数较高的有乙酸异戊酯（3.86%）、辛酸乙酯（5.92%）、乙酸苯乙酯（5.78%）、苯乙醇（37.66%）、D-柠檬烯（3.27%）；JZ-1酵母发酵橘子酒中检出的物质中相对质量分数较高的有乙酸异戊酯（10.32%）、正己酸乙酯（2.8%）、癸酸乙酯（11.82%）、苯乙醇（10.35%）、3-蒈烯（3.1%）；JZ-2酵母发酵橘子酒中检出的物质中相对质量分数较高的有乙酸异戊酯（4.06%）、辛酸乙酯（13.44%）、癸酸乙酯（3.84%）、苯乙醇（25.18%）、D-柠檬烯（2.18%）、3-蒈烯（4.16%）、(+)-枞油烯（2.04%）。

表1 5种酵母发酵橘子酒香气成分的检测

2.2 5种酵母发酵橘子酒香气成分分析

比较5种酵母发酵橘子酒香气成分，所得结果差异比较明显，共同检出的物质有乙酸异戊酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、9-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、苯乙醇、月桂烯、D-柠檬烯、萜品烯、3-蒈烯、(+)-枞油烯、波斯菊萜、巴伦西亚橘烯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。但这些共有的香气物质中，各种物质在5种酒中的含量差别比较大，普遍存在1.2～3倍的差距，有的甚至存在9～10倍的差距。乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯也在Kozan柑橘果酒中检出[4]。这些新生成的酯类物质是酵母在发酵过程中的初级代谢产物。在目前的报道中，有很多生香酵母可以产生苯乙醇。在高健等[5]分离的莴苣内生香酵母GC-MS检测中苯乙醇相对含量为5.21%，廖永红等[6]分离的产香酵母中苯乙醇相对含量更低,仅为3.49%，而付俊淑等[7]分离出的酵母菌产苯乙醇相对含量较高，为19.03%。苯乙醇是一种比较典型的芳香醇[8]，阈值较低，仅为10 mg/L，具有淡雅细腻的玫瑰香气，它也被认为是Kozan柑橘果酒的特征香气活性物质[4]。因此，本次筛选出的JZ-1和JZ-2酵母具备产大量苯乙醇的优势功能。D-柠檬烯有一种较弱的柑橘香味,当其含量低于190 ppm时，就是柑橘中的重要特征香气物质[9-10]。D-柠檬烯具有令人愉快的柠檬香气[11]。巴伦西亚橘烯是橙汁和橙皮中一种重要的倍半菇类物质,并被用做橙汁的质量指标。但Elston等[12]研究发现，巴伦西亚橘烯可以作为柑橘成熟度的判定指标,但对柑橘的整体香气没有任何贡献。1-戊醇、L-香芹醇、g-芹子烯、壬醛、2-乙氧基噻唑只在安琪果酒酵母发酵橘子酒中有检出；甲酸异戊酯只在FX 10酵母发酵橘子酒中有检出；α-金合欢烯、d-杜松烯只在高温酿酒酵母发酵橘子酒中有检出；α-水芹烯只在JZ-1酵母发酵橘子酒中有检出。当1-戊醇、L-香芹醇、1-辛醇这些高级醇类物质的浓度低于300 mg/L时，就会产生令人愉悦的香气[13]，这些醇类物质也是酵母在发酵过程中的初级代谢产物。α-蒎烯也是柑橘的特征香气物质，除了JZ-1酵母酿造的酒中没有检出外，其他酒都有检出。Selli等[4]曾指出乙酸乙酯也是柑橘果酒的特征香气物质，在安琪果酒酵母、JZ-1、JZ-2酵母酿造的酒中有检出。

这说明经过发酵酿造，5种酵母酿造的果酒都拥有柑橘果酒主体的特征香气组分(16种物质共有)，但也有各自独有的香气组分，存在特异性差异。从香气成分种类数量来看，安琪果酒酵母发酵橘子酒中检出最多，有32种，果酒香气成分最丰富。以柑橘果酒的特征香气活性物质苯乙醇和乙酸乙酯相对含量为根据，高温酿酒酵母酿造的橘子酒中苯乙醇相对含量最高，但不含乙酸乙酯；JZ-2酿造的橘子酒中苯乙醇含量较高，乙酸乙酯相对含量也是最高的，生香效果最好。

3 结论

对筛选出的2种野生酵母与3种商业酵母所酿橘子酒香气成分进行比较，5种酵母酿造的果酒的香气成分共检出38种。5种酵母菌酿造的柑橘果酒中香气组分的主体成分接近，都有乙酸异戊酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯等16种物质，但是各酵母菌种所酿果酒存在特有的香气成分，1-戊醇、L-香芹醇、1-辛醇这些高级醇类物质主要在安琪果酒酵母酿造的柑橘果酒中存在，g-芹子烯、壬醛、2-乙氧基噻唑只在安琪果酒酵母发酵橘子酒中有检出；甲酸异戊酯只在FX 10酵母发酵橘子酒中有检出；α-金合欢烯、d-杜松烯只在高温酿酒酵母发酵橘子酒中有检出；α-水芹烯只在JZ-1酵母发酵橘子酒中有检出。安琪果酒酵母发酵橘子酒中检出的香气种类数最多，有32种。高温酿酒酵母酿造的橘子酒中苯乙醇相对含量最高，JZ-2酿造的橘子酒中苯乙醇含量较高，乙酸乙酯相对含量也是最高的。总之，野生酵母JZ-2生香效果最好，安琪果酒酵母酿造的橘子酒，香气成分最丰富。5种酵母酿造的果酒有共同的果酒特征香气物质，香气组分又有特异性差异，基于各香气成分的阈值不同，各成分对主体香气的贡献率也不同，不同酵母对酿造香气主体的影响，有待于进一步深入研究，通过GC-MS结合GC-O进行嗅辨分析评价各香气组分的差异对主体香气的影响，将有助于对该问题的深入探讨。

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