脯氨酸内切酶对小麦啤酒中蛋白质分布的影响

张 杰，王家林，付丽平，付文静

（青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛 266042）

小麦啤酒的主要用料是小麦芽或者未萌发的小麦，与大麦相比，小麦芽的蛋白质含量较高，且通常以大分子存在，因小麦蛋白中含有稳定因子，较难裂解和去除，这就使得小麦啤酒易产生非生物浑浊[1-2]。小麦啤酒非生物浑浊的成分主要是由高分子敏感蛋白质和敏感多酚交联在一起形成的絮凝物[3]。这种敏感蛋白主要由脯氨酸构成，非生物浑浊形成的难易程度与其脯氨酸的含量有直接关系[4-5]，当蛋白质与小分子的多酚经过细微的交联结合在一起时，即形成“冷浑浊”；当越来越多的蛋白质和多酚交联结合，便构成了“永久性浑浊”[6]。脯氨酸内切酶是一种只作用于脯氨酸的酶，该酶可以通过裂解脯氨酸而使浑浊蛋白失活[7-8]。本实验主要研究脯氨酸内切酶对小麦啤酒中蛋白质分布的影响，探究脯氨酸内切酶对小麦啤酒的非生物浑浊及泡沫稳定性[9]的影响程度，为生产优质的小麦啤酒提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料及耗材：大麦芽和小麦芽，青岛啤酒有限公司；啤酒酵母，青岛科技大学生物工程实验室菌种；脯氨酸内切酶（酶活力1733 U/mL），青岛蔚蓝生物科技有限公司。

仪器设备：Hermo legend RT+型离心机EBCLF，武汉爱斯佩科学仪器有限公司；T标准麦芽粉碎机，北京德之杰公司；BGT-8A糖化仪，杭州博日科技有限公司；LRH-250生化培养箱电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

磷酸盐缓冲液（pH值为6.5～7）：配制2.72%的KH2PO4溶液和4.56%的K2HPO4溶液，分别从中取28 mL、72 mL，两者混匀配成100 mL 0.2 mol/L的溶液，再稀释成0.01 mol/L的溶液。

考马斯亮蓝G250：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，再加入85%的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容到1000 mL。此溶液在常温下可放置1个月。

1.2.2 小麦啤酒生产工艺

制麦：称取实验室大麦芽和小麦芽[10]，在EBC粉碎机中碎粉大麦芽和小麦芽。

糖化：每个糖化杯加入50 g麦芽粉和200 mL蒸馏水，按图1所示温度设定程序进行糖化[11]。

图1 糖化曲线

过滤：糖化后将麦汁降温至40℃过滤，收集约200 mL滤液[12]。

煮沸：煮沸时间为10 min，期间加入0.15 g啤酒花。

发酵：取100 mL煮沸完的麦汁加入10 g酵母，放入恒温箱中以12℃发酵2 d[13-14]。

泡沫的提取：将发酵后的啤酒从距桌面量筒25 cm处往下倒量筒，收集泡沫。

1.2.3 确定实验方案

确定酶制剂的添加方案见表1。

表1 所用的酶制剂

糖化阶段试验方案见表2。

表2 糖化阶段试验酶添加量

发酵前阶段试验方案见表3。

表3 发酵前阶段试验酶添加量

发酵后阶段试验方案见表4。

表4 发酵后阶段试验酶添加量

小麦啤酒泡沫试验方案见表5。

1.2.4 蛋白质的浓缩提纯方法

取待测样液25 mL，缓慢加入10.32 g(NH4)2SO4，使溶液达到80%的饱和度，静置沉淀1 h后，放入冷冻离心机以转速9000 r/min离心15 min，弃去上清液，用2.5 mL的1×PBS缓冲液溶解沉淀蛋白，溶解后继续离心10 min，用移液枪取2 mL上清液于小离心管中标号等待分析。

表5 小麦啤酒泡沫试验酶添加量

1.2.5 蛋白含量的测定

将47 mg/mL的标准蛋白样品进行稀释，然后测定不同浓度的标准样品在595 nm波长下的吸光度值和蛋白质含量，绘制标准曲线，取适当稀释的样品1 mL与7 mL考马斯亮蓝溶液反应，测其吸光值OD595，然后带入标准曲线，计算待测样品的蛋白质含量。

1.2.6 SDS-PAGE电泳实验

根据待测蛋白质的相对分子质量的范围，选择合适的浓缩胶、分离胶浓度，按表6所列的试剂用量配制。利用SDS-PAEG电泳方法测定样液中蛋白质的分子量。

表6 分离胶与浓缩胶的组成

2 结果与分析

2.1 标准曲线

利用紫外分光光度计测定一系列不同浓度标准蛋白溶液在595 nm处的吸光度值，得到回归方程y=1.638x+0.0271，R2=0.9989。标准曲线见图2。

2.2 各阶段添加脯氨酸内切酶后麦汁蛋白含量及麦汁蛋白分布

图2 标准曲线图

2.2.1 各阶段添加脯氨酸内切酶对小麦啤酒中蛋白质分布的影响（图3、图4、图5）

图3 糖化阶段和发酵前阶段电泳图

图4 糖化阶段和发酵前阶段电泳图

图5 小麦啤酒泡沫和发酵后阶段电泳图

2.2.2 各阶段添加脯氨酸内切酶后麦汁蛋白的含量

2.2.2.1 糖化阶段试验方案（表7、表8、表9）

表7 糖化时添加脯氨酸内切酶

表8 糖化时添加脯氨酸内切酶

表9 糖化时添加脯氨酸内切酶

⑤麦汁蛋白电泳图：添加酶制剂的电泳条带与空白无明显差别，且不随脯氨酸内切酶添加量增加发生明显变化。

⑤煮沸后麦汁蛋白电泳图：煮沸后麦汁中，30～70 KD的大分子蛋白质条带明显减少或消失，25 KD的小分子蛋白质条带明显增加，说明煮沸过程对麦汁蛋白分子量分布有显著影响。但与添加酶制剂无明显关系。

⑤啤酒蛋白电泳图：空白组在40 KD分子量时，条带明显，添加酶制剂后，该条带边模糊，说明糖化过程中加酶对啤酒40 KD左右的蛋白质有一定作用，随添加量增加而变浅。

表10 发酵前添加脯氨酸内切酶

2.2.2.2 发酵前阶段试验方案（表10）

啤酒蛋白电泳图，前两组样品在40 KD分子量时，条带明显，后随着酶制剂添加量的增多，条带颜色变浅较明显，且在第3组样品之后条带颜色变化不是很大。

2.2.2.3 发酵后阶段试验方案（表11）

表11 发酵后添加脯氨酸内切酶

啤酒蛋白电泳图：空白组在40 KD分子量时，条带明显，添加酶制剂后，条带边变模糊，说明加酶对啤酒40 KD左右的蛋白质有一定作用，随添加量增加条带颜色逐渐变浅。

2.2.2.4 小麦啤酒泡沫试验方案（表12）

表12 小麦啤酒泡沫添加脯氨酸内切酶

小麦啤酒泡沫蛋白电泳图5：从电泳图中可看出，添加酶制剂的电泳条带与空白无明显差别，且不随脯氨酸内切酶添加量增加发生明显变化。

3 结论

本实验探究了脯氨酸内切酶对小麦啤酒生产过程中各个阶段蛋白分布的影响，研究表明，糖化阶段前添加该酶对小麦啤酒中蛋白质的分布影响不大，煮沸过程中由于高温使酶变性分解；在发酵阶段前添加对小麦啤酒中蛋白质的分布影响较大，42 U/mL为酶的最适添加量；在小麦啤酒发酵阶段后添加对小麦啤酒中蛋白质的分布没有太大影响；由于小麦啤酒泡沫中脯氨酸的含量较低，加入脯氨酸内切酶后，即使有作用，效果也不显著。

将脯氨酸内切酶应用于小麦啤酒酿造的过程，是用生物技术手段代替传统的吸附分离技术来避免小麦啤酒产生非生物浑浊的一种行之有效的方法，在发酵前期加入适量脯氨酸内切酶，有利于提高小麦啤酒的非生物稳定性，澄清啤酒色泽，改善啤酒品质，为工业生产提供了理论支持，为加快我国啤酒产业的健康、快速发展奠定了坚实的基础。

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