中高温大曲发酵过程微生物消长规律探析

李燕荣，杨 勇，张龙云，谭洪弟，姜 雷，郭风雪，宋 宝

（江苏洋河股份有限公司，江苏宿迁223800）

古语有云：“曲乃酒之骨也”，洋河绵柔型风格白酒的酿造自然离不开绵柔型中高温大曲。大曲在白酒酿造中既是糖化剂、发酵剂又是生香剂，不但含有丰富的微生物区系和酶系，还蕴含白酒风格形成的各种呈香呈味前体物质，同时还作为酿酒的原料，因此大曲在酿酒生产中的作用不言而喻，其品质好坏决定着酒的风格及档次。

本文对中高温大曲制作发酵期全流程进行跟踪取样，并首次将曲样细分为曲皮样和曲心样，分别针对曲皮和曲心中的微生物消长变化规律进行研究分析，着力探析发酵期绵柔型中高温大曲由外及里微生物的动态消长变化规律，旨在全面剖析发酵期大曲微生物更迭全过程，为制曲工艺优化和现代化制曲提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

曲样：采样方法见1.3.1。

仪器设备：酒精温度计，粉碎机，高压蒸汽灭菌锅，超净操作工作台，1 mL移液枪，200 μL移液枪，玻璃涂布棒，恒温培养箱。

1.2 培养基

营养琼脂培养基：牛肉膏1.0 g，酵母膏2.0 g，蛋白胨5.0 g，氯化钠5 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4。

孟加拉红培养基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，孟加拉红0.03 g，琼脂20 g，氯霉素0.1 g，水1000 mL，pH 7.2±0.2。

1.3 试验方法

1.3.1 取样

对发酵期全流程进行跟踪并取样，将曲样分为曲皮样和曲心样，取样详情见表1。

将曲皮样和曲心样依据软硬情况，用粉碎机进行粉碎，过40目筛备用。

1.3.2 曲样微生物数的检测

梯度稀释涂布法：取5.0 g大曲粉，加入装有玻璃珠和50 mL无菌水的三角瓶中摇匀，经30 min充分浸提和静置后，用1 mL移液枪吸取1.0 mL上清液于装有9.0 mL无菌水的试管中，制成10-2梯度的稀释液，吸取该梯度的稀释液1 mL于装有9.0 mL无菌水的试管中，依照此操作次序制成10-3、10-4、10-5梯度的曲样浸出液。随后用200 μL移液枪分别取 10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5梯度的稀释浸出液200 μL于营养琼脂培养基和孟加拉红培养基中，用无菌的涂布棒均匀涂布后分别置于37℃培养箱和30℃培养箱中培养。营养琼脂板倒置培养24 h后取出检测细菌数量，孟加拉红板倒置培养36 h后取出检测酵母菌菌落数，48 h后取出检测霉菌数量。

表1 发酵各阶段取样汇总表

说明：正值伏天取样，以上培养基需放置在室内温度为25～27℃的环境中，方能正常使用，并实现上述各项操作。

1.3.3 曲样温度测定

对曲房四周和中心曲块的温度进行跟踪测定。具体操作方法是将酒精温度计插入曲样正中心位置，每日下午3时～5时定点查看曲块温度并记录。

1.3.4 曲样水分检测

将干燥箱温度调至130℃，待温度恒定后放入试样，烘烤60 min后取出，继而进行水分测算。

2 结果与分析

2.1 发酵期大曲温度

中高温大曲发酵周期为31 d，大曲发酵期温度变化及趋势（该实验跟踪的是7月份制大曲，发酵期大曲温度变化趋势会随季节有一些波动）见表2。由表2可知，在第1天和第2天主发酵阶段，曲温缓慢上升，该阶段大曲主要完成“穿衣”，曲皮被一层霉菌菌丝覆盖。此时霉菌菌丝进入曲皮，可引出曲块中的水分，而不至于使大曲中的水因无出口而膨胀裂口，素有“菌丝内插，水分挥发”的培养原理，自此每个曲块形成了一个“微氧”“独立”的小生态环境[1]。并房操作时，曲温略有下降。发酵第4天曲块温度和湿度急剧升高并进入潮火期，此时曲块温度在51～53℃之间；再经过2 d持续升温后，大曲发酵进入大火期，此时曲块温度可达60～61℃，这个温度可以持续5～6 d（占火期），占火期后曲块温度开始回落，回落速度平稳，进入后火期，该阶段的曲块温度也是缓慢下降。整个发酵期大曲温度变化符合“前火不可过大，后火不可过小，多热少凉不闪火”的规律[2]。之后，曲块进入养曲期，此时温度缓慢下降直至室温。

表2 发酵各阶段曲块温度表

2.2 发酵期大曲水分

大曲制作期水分变化及趋势见表3。由表3可知，曲块发酵的前12 d，曲皮水分散失较快，水分从37.96%下降到11.45%，曲块水分平均每天散失近2.2%，12 d后曲皮水分变化缓慢，处于较稳定状态，而与曲皮水分变化截然不同的是，曲心水分在10 d前变化幅度不大，每天下降约0.21%，但从12 d开始，随着曲温不断升高，曲心水分挥发幅度加剧，从表3曲心水分变化数据可知，这段时间水分呈直线下降趋势，在大曲发酵后期短短16 d中，曲心水分从35.90%直线下降到13.16%，平均每天下降约1.42%，与前期10 d每天下降0.21%相比可知，曲心水分在大曲发酵后期随着曲心温度的不断升高及微生物的大量繁殖而加剧消耗挥发。

表3 发酵期大曲水分

2.3 细菌动态变化规律

细菌是大曲的“生香动力”，是多种香味物质产生的源泉[3]。大曲发酵期细菌数量变化幅度小，且在微生物总数上占据绝对优势。由表4可知，主发酵阶段曲皮细菌数量即达到峰值，整个大曲发酵期间，曲皮细菌数量始终多于曲心，除了第7天、第8天和第9天，这3 d的曲心细菌数量多于曲皮，并且曲心处细菌在发酵第9天达到峰值，结合曲块水分和温度共同分析，这期间曲块温度迅速升高至大火期，曲皮水分散失严重，不能满足微生物的繁殖所需，而此时曲心水分充足，曲心处“高湿”“微氧”的环境极利于微生物的生长，尤其是耐高温芽孢杆菌的生长繁殖[4]。大曲发酵后火阶段，随着曲块温度的回落，曲心处细菌数量大幅减少，直至此后的其他阶段，曲心细菌数量变化不大，而与此同时曲皮处细菌数量由于曲温的下降，加上“微氧”“微湿”的微环境所致，其细菌数量反而呈现回升势头。从表4也能看出，在发酵后期第10天起，曲皮细菌数量增值幅度显著高于曲心，而此时曲心处细菌数量变化曲线表现平稳，变化幅度小，几乎无变化。

表4 发酵期大曲曲皮和曲心细菌数量

2.4 霉菌动态变化规律

霉菌具有较强的糖化酶兼具蛋白水解酶合成功能，与大曲的糖化力和液化力显著相关[5]。从表5可知，整个发酵期曲皮处霉菌数量变化幅度较大，曲皮和曲心的霉菌在主发酵阶段和并房潮火阶段均达到峰值，此时曲皮霉菌数量可达107cfu/g，曲心霉菌数量则在104cfu/g，曲皮霉菌数量是曲心的数千倍。随着曲温的不断升高，大火期曲皮和曲心处的霉菌显著减少。此时曲皮霉菌数量维持在105cfu/g，是曲心的数百倍，两者最大差距可达数千倍。后火阶段和养曲阶段，曲皮霉菌数量是“一跌再跌”。大曲发酵期末，曲皮霉菌数维持在103～104cfu/g。曲心霉菌数自大火期始，数量变化不大，数量稳定维持在几百个。从这期间霉菌数的变化可知，霉菌的繁殖对于氧气和湿度要求较细菌菌落严格，而且对于温度敏感，高温是霉菌的“天敌”，这也就解释了曲皮霉菌数始终远高于曲心的霉菌数量的现象。在发酵前期，曲块湿度较大，曲皮处氧气含量充足，此时霉菌得以大量繁殖，而此时曲心处尚存有少量氧气，且湿度较大，故曲心处霉菌也得以繁殖，而随着曲温的升高以及曲心氧气的不断消耗，曲心处霉菌繁殖缺乏了适宜的温度，同时又缺氧，自此其数量是“一落千丈”。

表5 发酵期大曲曲皮和曲心霉菌数量

2.5 酵母菌动态变化规律

酵母菌是发酵之母，是酒精发酵的主要动力。从表6可知，曲皮和曲心酵母菌在发酵第1天即达到顶峰，第2天开始回落，这与酵母菌极其不耐热的特性是紧密相关的。由表2可知，大曲发酵第1天曲块温度为44℃，第2天曲块温度已达到47℃，不同的酵母菌耐热程度是不一样的，一般的酵母菌能够在37℃以下生长，如果是固体发酵的话，温度达到45℃影响也不是特别大，温度再往上升，死亡率就特别高了[6]。主发酵期间，曲皮酵母菌和曲心酵母菌数量相当，均达到峰值（107cfu/g），此时曲皮和曲心都处在一个温度不是特别高，湿度适宜的状态；并房后至潮火期，曲块温度由表及里逐渐升高，曲皮温度小于曲心温度，曲皮酵母菌（104～105cfu/g）比曲心酵母菌（103～104cfu/g）多一个数量级；进入大火期后，曲皮和曲心温度均超过50℃，曲心温度更是高达60℃，在这个温度下是没有酵母菌能够存活，因此自大火期后不管是曲心还是曲皮，受制于温度的影响，酵母菌菌落在10-1曲样梯度稀释液中未有检出，但不排除大曲样中有酵母菌，可通过液态培养基进行酵母菌的富集试验进行进一步的佐证。

表6 发酵期大曲曲皮和曲心酵母菌数量

3 结论

微生物的生长繁殖与其存在环境中的水分和温度是分不开的，这两个指标对于微生物的生长具有决定性的作用，因此本研究结合了发酵期各阶段的温度和水分指标，对发酵期绵柔中高温大曲的细菌、酵母菌和霉菌3种主要微生物动态变化进行了总结分析，初步明晰了各自的消长规律。

正如文中所说细菌是“生香动力”，霉菌是“糖化动力”，酵母菌是“发酵动力”，但是这些指标都是相互作用的，不能孤立着看，要完整剖析大曲发酵期的动态变化，达到充分认识这个动态变化过程，并将之指导与应用于大曲生产实践中去，需要尽可能多地对发酵过程中的各因子去做分析，并做好相关性分析，因此下一步将对发酵期的主体微生物及其相关酶活等理化指标进行研究分析，同时结合本文的微生物动态消长规律，最大程度地揭示大曲发酵培养全过程的内在机理，以期为机械化制曲及制曲工艺优化提供扎实的理论指导。