酸性蛋白酶和纤维素酶在玉米燃料乙醇生产中的联合应用

惠继星，范 锐，岳 军，宁艳春，屈海峰，胡世洋，王继艳

（1.中国石油吉林石化公司研究院，吉林吉林132021；2.吉林燃料乙醇有限责任公司，吉林吉林132101）

我国是一个生物质能源生产和应用大国，以燃料乙醇为代表的生物质能源对保障国家能源安全起到了重要作用[1]。随着我国燃料乙醇的不断推广和应用，预计到2020年燃料乙醇年利用量将达到1000万t[2]。现阶段，在燃料乙醇生产过程中，大规模应用且来源广泛的原料主要是玉米、小麦、薯干等粮食作物和木薯等非粮作物[3-4]，这些原料发酵生产的酒精统称为淀粉质原料酒精。乙醇发酵中，淀粉到葡萄糖的转化率高低直接影响到原料消耗量以及菌体可利用糖量，最终影响到乙醇产量的高低。如何提高乙醇生产的葡萄糖转化率，提高乙醇产量以降低乙醇生产成本已成当务之急[5]。20世纪90年代后，随着酶工业和酵母工业的产业化，越来越多的研究人员尝试将不同的酶制剂应用于发酵生产酒精以提高发酵速率和原料出酒率，从而降低酒精生产成本[6]。

以玉米为原料生产酒精时，在发酵过程中添加适量的酸性蛋白酶，一方面能有效地水解原料中的蛋白质，破坏原料细胞壁结构，利于糖化酶的作用，使原料中可利用的糖增加，从而提高淀粉出酒率；另一方面，由于蛋白酶的水解作用，增加了醪液中可被酵母利用的有机氮，促进了酵母的生长和繁殖，增强了酵母菌的产酒能力，提高发酵速度，缩短发酵周期[7]。在玉米原料酒精发酵过程中添加适量的纤维素酶，一方面能将部分纤维素水解成可发酵性糖供酵母菌利用，从而提高淀粉出酒率；另一方面能破坏原料细胞壁结构，促进淀粉、蛋白质等有效成分的溶出，对提高淀粉出酒率有积极作用[8]。有关酸性蛋白酶和纤维素酶应用方面的报道较多，但是酸性蛋白酶和纤维素酶联合应用于玉米燃料乙醇的报道较少。本实验研究了酸性蛋白酶和纤维素酶联合应用对玉米燃料乙醇发酵过程的影响，研究二者是否存在协同作用，并确定适宜的添加量，为工业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及设备

菌种：超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司。

实验耗材：市售玉米粉；酸性蛋白酶，山东蔚蓝生物科技有限公司，酶活力5万U/mL；糖化酶，诺维信公司，10万U/mL；耐高温α-淀粉酶，24万U/mL；纤维素酶，上海宝曼生物科技有限公司，150 FPU/g。

仪器设备：立式全温振荡培养箱，ZQPL-200，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；洁净工作台，SW-CJ-1FD；高压灭菌锅，MJ-78A，施都凯仪器设备（上海）有限公司；离心机，A14，Sartorius公司；液相色谱，LC-20A，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料液化、糖化

将市售玉米粉按料水比1∶3，用60～70℃温水调浆；95℃糊化液化120 min，液化酶加量为30 U/g玉米粉；60℃恒温糖化60 min，糖化酶加量为70 U/g玉米粉，得到玉米糖化醪。

1.2.2 酵母活化

称取0.3 g安琪超级酿酒高活性干酵母，加入装有100 mL无菌水的三角瓶中，在32℃，180 r/min的摇床中活化60 min。

1.2.3 发酵

向玉米糖化醪中加入1 mL酵母活化液，加入适量的酸性蛋白酶、纤维素酶，在转速180 r/min，温度32℃的摇床中开始发酵。

1.3 分析方法

1.3.1 乙醇浓度和葡萄糖浓度测定

取发酵液样品1.8 mL加入2.0 mL离心管中，在12000 r/min下离心5 min，取上清液稀释10倍，然后用0.22 μm的水系滤膜过滤，用液相色谱仪（检测器：示差折光检测器；流速：0.6 mL/min；流动相：0.005 mol/L硫酸；柱温：55℃）测定发酵液中乙醇和葡萄糖的浓度，按公式（1）计算样品中乙醇浓度，按公式（2）计算样品中葡萄糖浓度。

1.3.2 可溶性蛋白的测定

用电子分析天平准确称取0.1 g牛血清白蛋白，加入100 mL容量瓶中，加水定容至100 mL，振荡溶解，静置30 min，得到浓度为1 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液；取6支试管，用移液器分别加入0 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.10 mL浓度为1 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液，加去离子水定容至1.0 mL，振荡摇匀。取一个洁净的微孔板，依次加入20 μL上述不同浓度梯度的牛血清白蛋白溶液和200 μL蛋白定量试剂，静置10～15 min。利用微孔板光谱仪在波长为595 nm处，以未添加牛血清白蛋白溶液的试验组为对照，测定各孔板中液体的吸光度值。发酵液中可溶性蛋白浓度的标准曲线如图1所示。

2 结果与讨论

2.1 酸性蛋白酶对发酵液中可溶性蛋白浓度的影响

图1 可溶性蛋白浓度标准曲线

酸性蛋白酶能有效地水解原料中的可溶性蛋白成游离氨基酸，增加醪液中可被酵母利用的有机氮。酸性蛋白酶在接种前添加，添加量为10 U/g固体原料，自然pH值，发酵液中可溶性蛋白浓度随时间的变化如图2所示。

图2 发酵液中可溶性蛋白浓度随时间的变化

由图2可见，空白试验发酵液中可溶性蛋白浓度随发酵时间的延长而逐渐升高，表明酵母细胞不能直接利用可溶性蛋白；添加酸性蛋白酶试验的发酵液中可溶性蛋白浓度保持在相对较低的水平，表明酸性蛋白酶对发酵液中的可溶性蛋白具有较强的水解作用。

2.2 酸性蛋白酶对发酵周期的影响

微生物的生长离不开氮源，由于酸性蛋白酶的水解作用，增加了醪液中可被酵母利用的有机氮，促进酵母的生长繁殖，提高发酵速率。酸性蛋白酶在接种前添加，添加量为10 U/g固体原料，自然pH值，发酵液中乙醇浓度和葡萄糖浓度随时间的变化见图3。

图3 发酵液中乙醇和葡萄糖浓度随发酵时间的变化

由图3可见，添加酸性蛋白酶试验的发酵液中乙醇浓度明显高于空白试验，相应的发酵液中残余葡萄糖浓度明显低于空白试验，表明添加酸性蛋白酶对乙醇发酵过程具有明显的促进作用，发酵周期较空白试验缩短8 h。

2.3 酸性蛋白酶添加量的影响

酸性蛋白酶的添加量是影响乙醇发酵过程的重要因素，对提高乙醇发酵速率、降低燃料乙醇成本具有重要意义。酸性蛋白酶在接种前添加，自然pH值，不同酸性蛋白酶添加量的发酵液中乙醇浓度和葡萄糖浓度随发酵时间的变化见图4。

图4 发酵液中乙醇浓度随发酵时间及添加量的变化

由图4可见，发酵24 h，随着酸性蛋白酶添加量的增加，发酵液中乙醇浓度逐渐增加，当酸性蛋白酶添加量大于6 U/g固体原料时，随着酸性蛋白酶添加量的增加，发酵液中乙醇浓度增加缓慢；发酵32 h，当酸性蛋白酶添加量大于4 U/g固体原料时，随着酸性蛋白酶添加量的增加，发酵液中乙醇浓度增加缓慢；发酵44 h，各试验的发酵液中乙醇浓度停止上升，发酵结束，表明添加酸性蛋白酶可加快前期乙醇发酵速率，适宜在发酵前期添加。

2.4 纤维素酶添加量的影响

纤维素酶是一种复合酶，具有极高的活力，在糖化及发酵过程中，将原料中的纤维素、半纤维素及其他成分降解为可发酵性糖，供酵母利用，从而提高原料的出酒率。纤维素酶在接种前添加，自然pH值，不同纤维素酶添加量的发酵液中乙醇浓度、葡萄糖浓度随发酵时间的变化分别见图5、图6。

图5 发酵液中乙醇浓度随纤维素酶添加量的变化

图6 发酵液中残糖浓度随纤维素酶添加量的变化

由图5、图6可见，发酵16 h，随着纤维素酶添加量的增加，发酵液中乙醇浓度和残糖浓度相差不大；发酵32 h，随着纤维素酶添加量的增加，发酵液中乙醇浓度逐渐上升，相应的残余葡萄糖浓度逐渐下降，当纤维素酶添加量大于3 FPU/g固体原料时，发酵液中乙醇浓度和残糖浓度变化趋缓；发酵40 h，添加纤维素酶试验的发酵液中乙醇浓度明显高于空白试验，这是由于纤维素酶可使发酵液中残余的纤维素、半纤维素等转化为葡萄糖供酵母利用，产生更多的乙醇，较空白试验发酵成熟醪中乙醇浓度提高5 g/L，从而提高了原料的出酒率。添加纤维素酶试验的发酵周期较空白试验有所缩短，这是由于纤维素酶中除了含有纤维素酶以外，还含有对乙醇发酵过程具有促进作用的酶类。

2.5 两因素中心组合优化

试验以酸性蛋白酶、纤维素酶添加量为主要因素，以发酵液中乙醇浓度为响应值进行了2因素5水平的优化，利用minitab16软件对试验进行了2因素5水平中心组合设计，如表1所示。利用Statistic6.0软件进行响应面的分析，发酵24 h中心组合响应面如图7所示。

表1 2因素5水平中心组合设计

图7 中心组合响应面图（酸性蛋白酶与纤维素酶交互作用）

表2 中心组合因子水平设计及ρ（乙醇）值实验结果预测结果对比表 (g/L)

由图7可见，发酵24 h发酵液中乙醇浓度的回归方程为：z=54.6655+0.3609x+1.8736y-0.0286x2+0.4068xy-0.1941y2（式中，x为酸性蛋白酶添加量，单位为U/g固体原料；y为纤维素酶添加量，单位为FPU/g固体原料；z为乙醇浓度，单位为g/L）。经统计学分析，模型的P＜0.05，表明添加纤维素酶和酸性蛋白酶对发酵液中乙醇浓度影响显著，数学模型R2为97.82%，表明该模型显著，可以很好地对实验结果进行预测[9]。当ρ（酸性蛋白酶）与ρ（纤维素酶）同时处于低水平时，乙醇浓度处于较低值；反之，当ρ（酸性蛋白酶）与ρ（纤维素酶）同时处于高水平时，乙醇浓度处于较高值；当ρ（酸性蛋白酶）处于低水平，ρ（纤维素酶）大于2 FPU/g固体原料时，乙醇浓度升高显著；当ρ（纤维素酶）处于低水平，ρ（酸性蛋白酶）大于6 U/g固体原料时，乙醇浓度升高显著。统计学分析表明，ρ（酸性蛋白酶）与ρ（纤维素酶）交互作用P值为0.082＞0.05，表明二者交互作用不显著。

2.6 酸性蛋白酶与纤维素酶联用回归方程验证试验

在酸性蛋白酶和纤维素酶联用的条件下进行乙醇发酵试验，发酵24 h发酵液中乙醇浓度的预测值和实际值见表2。

由表2可知，发酵24 h，发酵液中乙醇浓度的实际值与预测值相差不大，表明发酵24 h发酵液中乙醇浓度的回归方程可以对试验结果进行较准确的预测。

3 结论

采用单因素、2因素5水平中心组合的方法对纤维素酶、酸性蛋白酶的添加量进行了2次优化。结果表明：ρ（酸性蛋白酶）与ρ（纤维素酶）交互作用P值为0.082＞0.05，二者交互作用不显著；当ρ（酸性蛋白酶）处于低水平，ρ（纤维素酶）大于2 FPU/g固体原料时，乙醇浓度升高显著；当ρ（纤维素酶）处于低水平，ρ（酸性蛋白酶）大于6 U/g固体原料时，乙醇浓度升高显著。数学模型R2为91.86%，P=0.001＜0.05，模型显著，可以用于对实验结果的预测。