五粮液酿酒微生态与风味化学研究进展

郑 佳，赵 东，杨康卓，张建敏，刘 芳

（宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾644007)

五粮液，古称“重碧春、姚子雪曲、杂粮酒”等，是我国传统固态发酵白酒的典型代表[1]。独具特色的“5种粮食配方、包包曲、跑窖循环、双轮底发酵、分层起糟、分层蒸酒、量质摘酒、沸点量水”等优秀的传统酿造技艺在全国酿酒行业全面推广，极大程度上促进了我国白酒酿酒技术水平的发展。五粮液是我国多粮浓香型白酒的典型代表，老八大名酒之一，具有香气悠久、味醇厚、入口甘绵、入喉净爽、各味协调、恰至好处，尤以酒味全面而著称的独特酒体风格[2]。五粮液的酿造过程从包包曲制曲到糟醅发酵等多环节都与微生物及其栖息的环境息息相关，而原产地环境中微生物的类型、5种粮食配伍、糟醅理化结构、600年明初古窖池、窖池内厌氧状态下复杂菌群的共酵等多种因素决定了五粮液特殊的酒体风格[3]。研究各环节微生物群落的组成与相关风味物质的关联性是调控发酵过程的主要依据，因而，本文结合微生物学技术和风味化学技术的发展历程，回顾这些技术的不同发展时期在诠释五粮液传统工艺中取得的进展。

1 酿酒微生态研究进展

20世纪30年代初，我国老一辈微生物学家方心芳、陈騊声等采用传统培养技术研究大曲的霉菌、酵母的成果奠定了我国酿酒微生物发展的基础，促进了工业微生物的发展。新中国成立初，“三大试点”这一系列重要历史事件是对“浓、清、酱”三大白酒香型在工艺操作参数、风味物质分析以及特殊功能菌株的筛选等方面进行了系统的分析[4]。1980年至2000年，传统分离培养法广泛应用于功能菌株的选育，2000年后分子生物学技术逐渐广泛应用于酿酒微生物群落的分析中。

目前，微生物群落的研究技术主要包括了传统分离培养技术、生物标记法和现代分子生物学免培养技术。下面就五粮液酿造过程中各环节涉及的微生物研究进行详细论述。

1.1 包包曲

俗语道“曲乃酒之骨”，大曲不仅作为白酒发酵的糖化剂和发酵剂，更是白酒糟醅发酵过程中微生物和粗酶制剂的主要来源之一。大曲的培养过程是原料表面附着的自然环境中微生物受曲块自身理化变化及曲房温湿度等因素影响而发生定向演替并形成特殊群落结构的过程。五粮液酿造用大曲为包包曲，属于中温偏高温曲，因“包包”部位较厚，在培菌过程中其品温相对较高，可达63℃。不同地域的中高温曲中微生物群落的研究结果[5-6]认为，芽孢杆菌种类和数量较多，细菌中优势菌群是乳酸杆菌属(Lactobacillus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)等；曲块不同部位微生物的差异比较结果认为霉菌尤其是根霉(Aspergillus)是曲块侧面和曲包表层的优势类群，曲心的优势菌群主要是芽孢杆菌，曲块底面主要是青霉和犁头霉，而黄曲霉、红曲霉和酵母菌在曲块各部位均有检出。赵东等[7-8]分析了五粮液包包曲培曲过程中细菌、酵母和霉菌的变迁规律，认为包包曲培养过程中枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌占绝对优势；同时，在曲坯发酵过程中，酵母菌、霉菌和细菌的数量在前期急剧增加，第5天后显著减少，14～18 d期间细菌有较大幅度的生长，随后又下降。

随着分子生物学的飞速发展，宏基因组测序是近年来快速发展并渗透至多学科的有效的基因测序手段，无需分离纯培养单一菌株，提取体系基因组DNA后，直接在基因水平研究挖掘环境中微生物群落资源，同时，该方法体系具有成本低、通量高、覆盖率高等优点。施思等[9-10]利用MiSeq高通量测序平台分析了包包曲在贮存过程中原核微生物和真核微生物菌群的变化规律，包包曲中主要的原核微生物包括 Bacillus、Lactococcus、Thermoactinomyces、Sebaldella、Weisilla等，真核微生物包括Pichia、Rhziopus、Lichtheilia、Saccharomycopis等。陈玲等[11]基于Illumina Miseq测序平台分析了某浓香型大曲中细菌群落的结构组成，高通量测序发现了13个门，22个纲，33个目，61个科，133个属，厚壁菌门（79.32%）、变形菌门（15.04%）和放线菌门（1.77%）是优势的细菌菌群，在属的分类水平中Bacillus、Lactobacillus、Weissella、Pantoea、Lactococcus等是优势属。

1.2 糟醅

高粱、玉米、小麦、糯米、大米5种粮食配方是五粮液区别于其他中国白酒的特色之一。赵东等[12-13]分析了五粮液糟醅发酵过程中细菌（好氧、兼性厌氧）、酵母和霉菌的变化趋势，结果发现好氧细菌、酵母菌和霉菌数量在发酵初期急剧增加，5 d后急剧减少；而兼性厌氧细菌数量在发酵前期急剧增加，而后急剧减少；发酵5～15 d酵母菌占优势，到15 d后，则是兼性厌氧细菌占优势。进一步分析不同空间糟醅发酵过程中[13]微生物分布状况发现，中层糟醅的好氧细菌数量略大于上层和下层，下层糟醅中酵母菌和兼性厌氧菌数量最多。

1.3 窖泥

泥窖发酵是浓香型白酒显著区别于其他类型白酒的典型特征。泥窖窖池，窖池四壁和底面均粘附有老窖泥，由于窖池内窖泥与糟醅长期接触，在糟醅的浸润下，窖泥吸收了大量的酸、酯、醇和其他营养物质，供给窖泥中栖息的微生物生长、繁殖，糟醅发酵时，窖泥中的微生物又进入糟醅中增殖代谢。糟醅中的特殊风味成分在长期不间断续糟发酵过程中不断积累，糟醅与窖泥的长期互动形成了“以糟养窖，以窖促糟，糟窖互养”的良好生态环境。由于不同酿酒原料为窖泥微生物营造的理化环境截然不同。20世纪90年代初，吴衍庸等[14]基于传统分离培养技术剖析了五粮液老窖泥中厌氧微生物的群落结构，结果表明，己酸菌和厌氧异养菌等随窖龄延长而增加，己酸菌、甲烷菌等随窖池上、中、下位置顺序递增。最近，赵东等[1]利用高通量基因测序方法深入研究了五粮液窖泥中原核微生物群落的组成，共检出22个门，52个纲，89个目，168个科，330个属，细菌是原核微生物群落的优势菌群细菌，占总菌数的92.3%。厚壁菌门（Fimicutes）是所有样品的绝对优势菌群（85.6%），共检出74个属，Clostridium、Lactobacillus、Coprococcus、Caldicoprobacter、Soehngenia 是丰度最高的细菌属；五粮液窖泥中蕴藏了显著区别于其他浓香型白酒窖泥的原核微生物群落，尤其是群系复杂的厚壁菌门细菌、较高丰度的产己酸菌群和促进己酸生成的甲烷菌群。可见，以五粮液为典型代表的浓香型白酒与酱香型、清香型等其他香型白酒在发酵设备及机理方面存在巨大差异，复杂的窖池微生态菌群是造就五粮液特殊酒体风格的根本原因之一。

2 风味化学研究进展

白酒风味物质中，除了极少量的无机化合物（固形物）之外，绝大部分是有机化合物，均具有挥发性，起到呈香呈味的特定作用。这些风味物质是构成白酒典型特征的物质基础。它们以一定的比例共存于酒体中，互相配合、补充、衬托和制约，发挥各自的特点，形成不同香型和不同风格的白酒。白酒香味物质十分复杂，种类繁多，含量微少，能够完全说清楚其来源实非易事。结合白酒的生产工艺及各类物质的生成机理，白酒的风味物质来自于原料、制曲产生的前体物质、窖泥中香气的转移和陶坛陈酿等，形成了白酒独特的酒体风格。

2.1 酿酒原（辅）料中的风味物质

原料是酒类酿造的基础，经处理后的原料不仅为发酵过程中微生物的新陈代谢提供营养物质，同时其中含有的大量香气前体物质和功能成分等显著影响产品的风味。对5种粮食香气前体物质的研究发现，有35种结合态香气物质，包括酯、酸、醇、醛酮、萜烯、芳香族等，如苯乙醛、四甲基吡嗪、2-戊基呋喃、β-大马酮、α-柏木烯、α-萜品烯、香叶基丙酮、脱氢-β-紫罗酮等[15]，这些结合态香味前体物质在发酵过程中，受酶类、有机酸等因素的作用直接或间接形成游离态的呈香呈味成分。谢正敏[16]、练顺才[17]、彭智辅[18]、叶华夏[19]等采用同时蒸馏萃取和顶空固相微萃取（HS-SPME）法定性分析了玉米、高粱、大米、糯米和小麦中的香气成分，发现了不同原料中大量的香气物质。我们的最新研究结果表明[20]，生产用五粮粉中含有独特的风味物质，一次蒸煮馏出液中最重要的香气活性成分包括2-甲基丁醛、己醛、(E)-2-庚烯醛、苯乙醛、愈创木酚、邻甲酚、对甲酚、己酸乙酯、二甲基三硫醚和β-大马酮（香气稀释因子（FD）≥81）。

2.2 包包曲中的风味物质

大量研究证实中国白酒酿造大曲不仅为酿酒过程提供了酶类、微生物菌种，而且大曲在制曲过程中产生的香气成分或香气前体物质对白酒酿造产生着重要的影响。五粮液包包曲采用纯小麦制曲，属偏高温大曲。赵东等[21]首次将HS-SPME应用于研究包包曲粉中的香气成分，共检出挥发性成分68种，其中近30种吡嗪物质以及与成品酒香气成分相似的化合物，如乙酸、己酸、己酸乙酯等。Zheng等[29]首次集成现代风味化学主流研究手段包括感官分析、色谱-感官嗅辩分析、色谱定量分析、香气贡献度评价以及多元统计学分析等，系统研究了包包曲制曲过程中香气成分的变化规律，包包曲的感官特征从升温阶段的酸涩味、果香味和面包味（3 d和7 d）演变为降温阶段的坚果味和稍许霉味（18 d、21 d和27 d）；根据香气时间强度值（Osme），表明乙酸、甲硫醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯、4-乙烯基愈创木酚是香气活性成分。

2.3 窖泥的风味物质

五粮液不同空间窖泥与糟醅的互动关系研究结果发现，窖边糟与窖泥的挥发性香气成分的组成类似，含量差异大，窖泥中检出的酯类数量较多，而这些酯类成分不仅仅局限于乙酯类化合物，优势酯类成分包括乙酸乙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、癸酸乙酯、辛酸丁酯等[22]。而单粮浓香型白酒窖泥挥发性香气成分的研究结果表明，己酸、己酸丁酯、己酸己酯是窖壁泥的主要成分，而窖底泥中亦含有丰富的己酸甲酯[23]。

2.4 独特的发酵工艺形成的风味物质

白酒采用固态发酵、混蒸混烧工艺，蒸馏后的糟醅拌合曲粉进行边糖化边发酵的多边发酵机制，且发酵时间较长，发酵期60～90 d，尤其是五粮液双轮底工艺的发酵期超过了100 d，极大程度地增加了底窖中糟醅香味成分的积累程度。五粮液是固态续糟发酵的典型代表，其独特的“跑窖循环、双轮底发酵、分层起糟、分层蒸馏、量质摘酒、沸点量水”等突出传统工艺是保证五粮液独特酒体风格稳定的根本。赵东等[24]利用HS-SPME法定性分析了糟醅中的芳香族成分，检出了4-乙烯基愈创木酚、苯乙醛、乙缩苯乙醛、香草醛等。由于白酒糟醅蒸馏操作并不能完全将糟醅中的香味成分完全蒸出，蒸馏后的糟醅中还残留了大量的香味成分，总提取效率底窖糟和面糟分别为8%和11%，乙酸乙酯提取6.62%～9.62%，己酸乙酯提取32.54%～29.39%、乳酸乙酯提取8.24%～10.41%、己酸-乙酸-乳酸残留90%以上[25]。因此“万年糟”中富含的呈香呈味物质是保证五粮液酒质风格稳定的根本因素之一。

2.5 蒸馏及陈酿对白酒风味物质的影响

白酒蒸馏器是一个结构特殊的桶状蒸馏器，现代化生产中已广泛使用耐酸碱腐蚀的不锈钢甑桶。糟醅属固体基质，其在甑桶中的疏松程度极大影响了白酒蒸馏效率，故糟醅装甑均采用人工装甑的方式。糟醅通过人工方式层层装填到甑桶中，形成了一个特殊的填料塔，水蒸气从甑桶底部逐渐穿透至糟醅顶层，糟醅层与层之间温度差造成了下层香味组分浓度在上层糟面冷凝，如此方式，甑桶内糟醅中酒精和香味成分经过复杂的浓缩过程。原酒的陈酿则用陶坛，陈酿周期为1～3年。研究结果表明，五粮液白酒中优势香味成分主要以酯类物质为主，其次为有机酸类，如己酸乙酯（1984 mg/L）、乳酸乙酯（1354 mg/L）、乙酸乙酯（1264 mg/L）、乙酸（465 mg/L）、己酸（296 mg/L）、乳酸（257 mg/L）、丁酸（104 mg/L）、乙缩醛（468 mg/L）、乙醛（355 mg/L）、双乙酰（118 mg/L）等[26]。

现代风味化学香气贡献度评价结果指出，对五粮液香气的贡献作用较大的挥发性成分包括丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸、1，1-二乙氧基-3-甲基丁烷、2，5-二甲基-3-乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪，3，5-二甲基-2-戊基吡嗪等[27]。低度五粮液与高度五粮液的比较结果认为[2]，低度与高度五粮液中骨架香味成分的相对比例较一致，低度白酒在己酸乙酯等骨架成分上含量低于高度五粮液；同时，果香类骨架物质（己酸乙酯、丁酸乙酯等）的香气强度顺序基本一致，能使低度与高度五粮液在气味风格保持一致，而酸类物质和芳香族类物质在低度与高度五粮液中优势物质的排列顺序不同，尤其是部分呈显著药材香和甜香味物质（苯乙酸乙酯、4-甲基愈创木酚等）。

3 展望

目前为止，采用高通量测序法分析得到了与酿酒相关的微生物菌群大于300个属，采用现代色谱分析仪器从白酒中定性分析到的风味物质达1000种以上，这些手段极大程度上扩展了我们认识白酒酿造过程涉及的微生物及与之相关的风味物质。然而我们对混菌发酵体系中微生物代谢的本质规律仍然不够深入，复杂体系中代谢网罗的相互交错使得我们认识白酒发酵机理困难重重。最近，一种直接研究微生物群体和他们栖息的环境或者宿主相互关系、作用机制的研究依然兴起，这便是微生物组[28]。基于微生物组中多种现代分析手段（高通量测序、高通量菌株筛选等）将对白酒酿造全过程的认识与改造产生重要影响，同时，对特定微生物群体代谢的调控手段将为白酒发酵代谢调控提供重要思路。