酱香高温大曲、酒醅和窖泥的真菌多样性分析

沈 毅，程 伟，邓小波，陈 波，王 西，甘浪飞，张亚东

（四川省古蔺郎酒厂有限公司，四川古蔺646523）

酱香型白酒是我国的一种主要香型白酒，具有酱香突出、酒体醇厚、回味悠长和空杯留香等特点[1]。郎酒作为经典酱香型白酒的代表之一，其生产依赖传统的高温制曲、原料清蒸、入窖前堆积、多次发酵取酒等工艺。由于传统的开放式生产过程及固态发酵中的不可控因素，来自高温大曲、酒醅和窖泥的多种复杂菌种参与混合发酵，郎酒微生物菌群组成一直不够明确，其菌群多样性有待阐明[2-3]。早期研究集中于白酒发酵过程中高含量的细菌菌群，对其种类和多样性进行研究，发现细菌菌群对白酒品质和风味物质形成具有重要影响[4-5]。近几年研究发现，真菌菌群作为酿造微生物群落的重要组成部分亦具有非常重要的作用（产酒精、产酶和产香），如真菌菌群在制曲前期和高温堆积发酵中具有高于细菌菌群的数量，且酿酒酵母是酒精生成的主要功能菌，曲霉菌和根霉菌具有很强的酯化酶和糖化酶活力，产酯酵母可形成以乙酸乙酯为主体的复合香气[6-10]。本研究致力于探究酱香型郎酒酿造过程中真菌菌群的组成特征及其多样性分析，为明确郎酒酒香的来源，保持酒品的稳定性奠定基础。

目前，围绕酱香型白酒发酵微生物的研究，多采用分离培养的方法通过表型和生理生化特征对微生物种类进行鉴定，随后通过变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术、rRNA基因克隆文库技术等解析微生物群落结构。鉴于一些微生物菌群不可培养的特征以及解析深度的匮乏，酿酒微生物的丰富组成和变化仍有待深入研究[11-12]。近年来，分子生物学技术广泛应用于微生物多样性的研究，尤其是高通量测序技术。高通量测序技术不仅具有数据量高、覆盖面广、准确率高的特点，还可以全面地定性和定量揭示样品微生物菌群的多样性和组成信息[13-14]。该技术非常适合用于白酒酿造过程中复杂微生物体系的研究。因此，本研究应用高通量测序技术，以酱香型高温大曲、酒醅和窖泥为研究对象，解析其真菌菌落结构和多样性，以期能够全面准确地分析酱香型郎酒在高温制曲、高温堆积和多次发酵取酒的生产过程中不同材料中的真菌菌落结构和差异，为酱香型郎酒高温制曲、高温堆积发酵工艺的改进和完善提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

曲样：本实验所有样品均采集自郎酒公司，其中高温大曲取自贮存1个月的新制成品曲，酒醅取自第4轮次堆积的酒醅中间部分，窖泥为窖底泥，上述样品均装入无菌采样袋后置于低温保存。

耗材及试剂：高质量DNA提取试剂盒Power-Soil DNA Isolation Kit购自美国MO Bio公司，微生物高通量测序建库试剂盒购自北京百迈克公司，Phusion HF MM高保真PCR酶购自美国BioLabs公司，MinElute®PCR Purification Kit购自德国Qiagen公司，Sample Preparation Kit购自美国Illumina公司，Taq DNA Polymerase购自北京全式金公司，电泳相关试剂购自北京全式金公司，引物（ITS1-F1：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'/ITS1-R1：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）合成于北京华大公司等。

仪器设备：Illumina HiSeq 2500测序平台，美国Bio-Rad公司；S1000 PCR仪，美国Bio-Rad公司；CFX96荧光定量PCR仪；美国伯乐BIO-RAD Gel Doc™XR+凝胶成像系统；北京六一仪器厂DYY-8C水平电泳槽；德国IKA公司VORTEX-3旋涡混匀器；德国Eppendorf公司Research Plus移液器；德国Beckman公司Allegra X-22R低温冷冻离心机；日本三洋公司超低温冰箱，准微量分析天平BT25S；德国Eppendorf BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪；美国Thermo公司NanoDrop 2000超微量分光光度计；优普UPT纯水机等。

1.2 试验方法

1.2.1 高温大曲、酒醅和窖泥的菌群基因组DNA提取

本实验基因组DNA提取按照PowerSoil DNA Isolation Kit说明书进行，其中裂解步骤如下：首先将样品置于灭菌烘干的研钵中，加入液氮研磨制备大小均一的粉末，准确称取0.25 g各样品至Power-Bead Tubes中，加入裂解液Solution C1后，在最大转速3200 r/min下连续涡旋振荡15 min，经碳化硅研磨珠的机械力和裂解液的化学反应共同作用下，充分裂解微生物，之后按说明书对微生物宏基因组DNA进行提取。

1.2.2 高温大曲、酒醅和窖泥的菌群DNA文库建立与测序分析

高温大曲、酒醅和窖泥的菌群基因组DNA用0.8%的琼脂糖电泳检测，利用超微量分光光度计测定其OD260/280值及其含量。同时我们设计了特异性引物（ITS1-F1/ITS1-R1）进行PCR扩增，PCR扩增程序为：95℃预热5 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共计30 cycles；72 ℃延伸10 min，PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目标产物的大小和条带信息。

各样品菌群DNA经质量检测合格后，通过针对ITS1区域的特异性引物分别进行PCR扩增。PCR扩增使用Phusion HF MM高保真PCR酶，PCR条件如下：98℃预热1 min；98℃变性10 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共计30 cycles；最后72 ℃延伸5 min。PCR结束后，利用Qiagen公司的Min-Elute®PCR Purification Kit，按照试剂盒说明书进行PCR产物纯化。针对纯化产物，我们利用Illumina公司的Tru-Seq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit制备测序文库并添加接头序列，文库经过Thermo NanoDrop 2000测定质量后，利用Illumina HiSeq 2500进行高通量测序。

1.2.3 生物信息学分析

利用FLASH[15]对测序获得的原始数据进行拼接，之后使用Trimmomatic[16]软件对拼接得到的序列进行质量过滤，并去除嵌合体（UCHIME[17]），获得高质量的Tags序列。利用UCLUST[18]软件在相似性97%的水平上对序列进行聚类，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[19]。基于UNITE[20]和RDP（Ribosomal Database Project）[21]对 OTU 进行分类学注释分析，同时计算该OTU在各样品中的相对含量、利用ClustalW2[22]软件以邻接法进行系统进化树分析，利用Mothur[23]软件对样品进行Alpha多样性分析等。

2 结果与分析

2.1 菌群基因组DNA的提取及ITS扩增

如表1所示，本实验成功从高温大曲、酒醅和窖泥中制备高质量的菌落基因组DNA模板，其OD260/280值在1.8～1.9之间，含量均高于50 ng/μL。由图1A可见，各菌落基因组DNA在电泳图中有非常清晰的单一条带，表1和图1结果说明，成功提取获得高质量的DNA。如图1B所示，从3个样品中各取用20 ng基因组DNA作为模板，利用靶向ITS1序列的特异性引物，从高温大曲、酒醅和窖泥的基因组DNA中扩增得到大小约250 bp的条带，符合预期片段大小，可以进行后续建库测序实验。

表1 菌群基因组DNA的OD260/280值及浓度

图1 基因组DNA和ITS1基因片段扩增的电泳结果图

2.2 样品测序数据处理结果

本研究收集的郎酒高温大曲、酒醅和窖泥样品共产出598,550对reads，双端reads拼接、过滤后共产生236,402条clean tags，平均每个样品产出78,801条clean tags（见表2）。去除引物和barcode后的序列平均长度分别为304 bp、258 bp和280 bp，Q30(%)为质量值大于或等于30的碱基占总碱基数的百分比，3种样品的Q30值均高于96%，说明数据质量较高。

表2 样品测序数据处理结果统计

2.3 序列丰度和多样性分析

如图2所示，在97%的相似度水平下，针对236,402条代表性序列进行聚类得到的各样品OTU个数分别为83、70和308，合计OTU数量为350个。同时对3种样品真菌菌群的构成进行比较分析，绘制得到的OTU-Venn图如图3所示，其中高温大曲、酒醅和窖泥共有的OTU个数为13，高温大曲和酒醅共有的OTU个数为25，高温大曲和窖泥共有的OTU个数为63，酒醅和窖泥共有的个数为46，而高温大曲、酒醅和窖泥特有的OTU个数分别为8个、22个和222个。

图2 高温大曲、酒醅和窖泥样品中OTU个数分布图

图3 高温大曲、酒醅和窖泥样品的OTU-Venn图

同时，经Alpha多样性分析得到高温大曲、酒醅和窖泥微生物的丰度指数（Chao1）和多样性指数（Shannon），其中三者的Chao1指数分别为123、91和 310，而 Shannon指数分别为 1.122、1.764和4.239。由此可见，郎酒窖泥中真核微生物具有最高的丰富度和多样性，丰富度其次是高温大曲和酒醅，但是酒醅中真核微生物的多样性高于高温大曲。

不同样品用不同颜色表示，不同颜色图形之间交叠部分数字为两个样品之间共有的OTU个数，多个颜色图形之间交叠部分数字为多个样品之间共有OTU个数，非交叠部分为各样品特有OTU个数。

2.4 基于各分类学地位对高温大曲、酒醅和窖泥的分析

在OTU划分的基础上，通过将OTU代表序列与微生物参考数据库进行比对分析，本研究对高温大曲、酒醅和窖泥进行分类学鉴定（表3），将序列鉴定为5个门，16个纲，40个目，77个科，109个属和148个种，其中仍有部分序列经过比对无法鉴定到已知的属和种。

表3 郎酒高温大曲、酒醅和窖泥样品的各分类学地位数量统计

针对样品中平均含量大于1%的真菌在属和种水平上进行相对含量比较分析，在350个OTU中，平均相对含量＞1%的OTU有20个，其中包含4个无法比对到已鉴定真菌菌属的未知OTU。在已知的属水平上，高温大曲中的优势菌属主要隶属于嗜热丝孢菌属（Thermomyces）、曲霉属（Aspergillus）和嗜热子囊菌属（Thermoascus），其平均相对含量分别为54.9%、24.2%和18.5%；酒醅中的优势菌属主要为假丝酵母属（Candida）、拟青霉属（Paecilomyces）和嗜热丝孢菌属（Thermomyces），其相对含量分别为55.1%、16.5%和15.1%；窖泥中的主要菌属为马拉色菌属（Malassezia）、被孢霉属（Mortierella）、枝孢属（Cladosporium）和曲霉属（Aspergillus），其相对含量分别为17.7%、10.1%、6.5%和5.3%。

在已知的种水平（图4），高温大曲的主要菌种包括疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus（54.9%）、曲霉属的Aspergillus cibarius（24.2%）和热子囊菌属的Thermoascus sp.（18.5%）；酒醅中的主要菌种包括假丝酵母属的Candida xylopsoci（52.3%）、拟青霉属的Paecilomyces formosus（16.5%）和疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus（15.1%）；而窖泥中的优势菌种包含限制性马拉色菌Malassezia restricta（17.3%）、枝孢属的Cladosporium halotolerans（4.4%）、被孢霉属的Mortierella antarctica（3.9%）和杂色曲霉Aspergillus versicolor（3.5%）。

图4 在种水平上高温大曲、酒醅和窖泥中优势真菌相对含量的比较分析

3 结论

本研究采用HiSeq 2500高通量测序技术，对郎酒高温大曲、酒醅和窖泥样品中的真菌微生物进行解析，研究显示三者之间的真菌菌群组成和多样性存在明显差异。

高温大曲作为酱香型白酒发酵中微生物的主要来源，掌握其中的主要风味微生物的种类和数量对于提高白酒的品质具有重要意义。鉴于酱香型郎酒高温制曲的特殊工艺，本研究发现,在高温大曲真菌微生物中，嗜热型真菌菌属占优势地位，其中嗜热丝孢菌属（Thermomyces）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）真菌的比例合计高达73.4%，上述结果与蒋英丽等[24]的最新研究报道相一致，通过追踪不同阶段的高温大曲微生物组成，研究发现，高温对酱香功能菌群的筛选和富集效应明显，在新制成品曲和储存曲块中，嗜热菌属具有非常高的相对含量。本研究中疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus不仅在高温大曲中占据了高达55%的比例，也在酒醅和窖泥菌群中得到鉴定（15.1%和0.4%），而该菌种同样广泛存在于酱香型茅台酒发酵过程中[25]，以及浓香型大曲[26]和泸州老窖大曲中[27]。Thermomyces lanuginosus的生长温度据报道可以达到真菌生存的最高温度60℃，该类群真菌可以分泌β-木聚糖酶，将植物细胞壁的主要组成成分木聚糖转化成木糖等[28-29]。此外，在高温大曲中还存在较高丰度的曲霉属（Aspergillus）真菌微生物，该菌属微生物广泛应用于酱油、日本清酒、中国黄酒等传统酿造行业，具有一定的耐酸能力，可分泌糖化酶，具有较高糖化力，可提高出酒率[30-31]，而在郎酒酱味相关研究中亦推测高温曲霉在酱香独特风味产生上具有重要的地位[2]。上述高温大曲中的研究显示，嗜热菌属和曲霉属在高温大曲中占据很高的丰度，对高温大曲的独特风味物质的组成和含量具有重要的影响。

酒醅在堆积过程中不仅利用来自高温大曲中已存在嗜热微生物菌属，还会吸附来自于空气和生产环境中的微生物，同时在堆积过程中的高温可再次对优势菌群进行富集，增加酒醅中风味物质的种类和含量，表明了酒醅中可形成独特的产菌群成分。在酒醅的真菌微生物分析中，研究发现，优势菌种包括假丝酵母属的Candida xylopsoci（52.3%）、拟青霉属的Paecilomyces formosus（16.5%）和疏棉状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus（15.1%），其中，假丝酵母属的Candida xylopsoci占据绝对主导地位，该菌种在酿造过程中作为主要的产酒功能菌发挥重要作用，同时，张春林等[32]在泸州高温大曲中筛选到酵母菌GY-3（即Candida xylopsoci）可作为产香的功能菌。Candida xylopsoci在新疆塔城牧区奶酪样品中及乳清和凝乳中作为主要菌种存在[33]，同时作为优势菌种存在于宁绍地区的特色腌制蔬菜腌制冬瓜中[34]。因此，我们推测假丝酵母属的Candida xylopsoci在郎酒堆积发酵过程可能参与香味物质的生成等，对于酱酒特殊性风味的形成具有重要的作用。对比酱香型郎酒高温大曲和酒醅的分析结果，揭示二者之间的优势菌群存在一定的异同。其中，嗜热丝孢菌属（Thermomyces）在大曲和酒醅均可作为优势菌属，而酒醅中的其他优势菌属则由假丝酵母属和拟青霉属组成。我们推测，尽管酒醅中含有少量成品曲粉导致其与高温大曲微生物菌群的初始组成非常相似，且堆积过程中酒醅核心温度接近高温制曲温度，但是制曲过程采用生料，而酒醅发酵采用蒸煮后富含水分的熟料，即高温大曲和酒醅中微生物处于两种差异显著的培养发酵环境，因此可导致二者微生物组成存在较大差异。

窖泥作为酱香型白酒发酵过程中的重要组成部分，其所在的窖池窖龄越长，其富集的功能微生物越多，风味物质越丰富，而目前的应用集中于窖泥微生物的复合应用上，可有效提高原酒优质品率等[11]。窖池作为酒醅发酵的主要场所，提供独特的厌氧环境，并通过窖泥提供丰富的酿造微生物，产生多种对酒体有贡献的风味成分[35]。本研究发现，在相同含量的基因组DNA模板中，窖泥样品中通过建库测序得到的有效reads数最少，ITS1片段的扩增条带含量最少，表明窖泥中真核微生物占总微生物含量的比例相对于高温大曲和酒醅较低。有研究亦表明，在浓香型白酒发酵窖泥微生物中，原核微生物总类和丰度高于真核微生物，占据主导地位[36]。尽管窖泥真核菌群在总微生物中未占据优势地位，但本研究揭示窖泥中真核微生物的丰富性和多样性远高于高温大曲和酒醅，在所有鉴定到的305个OTU中，属水平上相对含量超过1%的OTU有16个，呈现出丰富的真核微生物多样性，与高温大曲和酒醅中少数几个优势菌属占据超过近80%相对含量的现象存在显著差异。同时，本研究发现，窖泥中的主要菌属为马拉色菌属（Malassezia）、被孢霉属（Mortierella）、枝孢属（Cladosporium）和曲霉属（Aspergillus），上述菌属亦同样存在于其他白酒真核微生物组成中，参与白酒酿造过程中复杂的物质能量代谢和物质形态变化过程[36-38]。

综上所述，本研究采用高通量测序技术，对酱香型郎酒生产中的高温大曲、酒醅和窖泥的真菌微生物进行多样性解析和比较分析，结果显示，三者在真菌微生物多样性和组成上存在较大差异，其中窖泥中微生物丰富度和多样性最高，在窖泥中可以鉴定到大量共同存在于高温大曲和酒醅中的真菌菌种；高温大曲中主要由优势菌属嗜热丝孢菌属（Thermomyces）和嗜热子囊菌属（Thermoascus）组成；酒醅中优势菌属包括假丝酵母属（Candida）、拟青霉属（Paecilomyces）和嗜热丝孢菌属（Thermomyces），与高温大曲和窖泥的微生物组成存在显著差异。同时，本研究在郎酒高温大曲、酒醅和窖泥中鉴定到部分无法比对到已知序列的菌属和菌种，表明郎酒酿造过程中可能存在与风味和品质相关的独特未知菌种，后续还将开展更深入的研究进行解析。