高通量测序技术分析酱香型白酒下造沙轮次的微生物多样性

吕锡斌，吴耀领，郝 飞，曾祥炼，张巧玲，陈良强，袁 颉，罗汝叶，杨 帆，王和玉，王 莉，尉洪涛，韩培杰，白逢彦

(1.贵州茅台酒股份有限公司技术中心，贵州 仁怀 564501；2.中国科学院微生物研究所，真菌学国家重点实验室，北京 100101)

中国白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一，在中国文化和人民日常生活中发挥着重要作用[1]。酱香型白酒作为中国基本香型之一的白酒，其独特的传统酿造工艺使得酿造体系中形成了复杂的微生物群落结构，使其具有酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香持久等特点。因此，研究酱香型白酒酿造过程微生物群落结构，对解析酱香型白酒酿造机理、提高酱香型白酒产量及质量具有重大意义。

酱香型白酒酿造的工艺特点为：两次投料“下沙、造沙”、八次堆积发酵、九次蒸馏、七次取酒，最终由不同风格特点的轮次酒长期贮存，精心勾兑酝酿出高品质的酱香白酒。下沙、造沙轮次是酱香型白酒酿造的基础轮次，其工艺操作关系到后期轮次发酵过程中微生物的生长繁殖[2]，同时下沙、造沙轮次酒醅中可累积更多的微生物代谢产物及产酒轮次所需酱香型白酒前体物质，有利于后期轮次基酒香味物质的形成[3-4]。因此了解和掌握下沙、造沙酒醅微生物的多样性及其菌群变化，对揭示酱香型白酒独特的香味物质的形成机理，对保障后期轮次物料供给平衡和微生物代谢平衡，对酱香型白酒生产都至关重要，而目前对此的研究普遍较少。

本研究旨在通过Illumina Miseq PE300高通量测序平台测序研究分析酱香型白酒下沙、造沙轮次发酵过程细菌16S rRNA和真菌ITS高变区，研究堆积、窖内发酵酒醅中的微生物多样性及其主要功能群落结构，深入认识发酵过程的微生物多样性，解析制酒过程中细菌、真菌的组成、变化及其演替规律。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒醅：取自贵州茅台酒股份有限公司制酒车间。

菌种：细菌、真菌培养基购于国药集团化学试剂北京有限公司。

耗材及试剂：菌株DNA提取、16S rDNA片段和真菌ITS扩增所用的酶、Marker、dNTPs、Buffer等购于生工生物上海股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

仪器设备：Illumina Miseq PE300高通量测序平台测序；Vortex振荡器，德国IKA公司。

1.2 试验方法

1.2.1 取样方法

每个轮次酱香型白酒生产分为堆积发酵和窖内发酵两个阶段。如图1所示，在堆积发酵阶段0 d、1 d、2 d、3 d酒醅样品在堆积表面约20 cm深的D点取样。入窖时，对A、B、C、D和E点的5个酒醅样品进行收集。在窖内发酵过程中，对距离窖池边缘约30 cm，深度约120 cm的D点酒醅样品在发酵0 d、3 d、6 d、12 d、21 d、30 d以及出窖时进行收集，用于细菌和真菌的高通量测序。

图1 取样点图示

1.2.2 高通量测序分析方法

总体基因组DNA直接从样本中提取[5]，利用Illumina Miseq PE300高通量测序平台测序。细菌的16S rRNAV3—V4扩增引物为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3'），真 菌 扩 增 引 物 为ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR反应体系：12.5 μL 2× Taq PCR MasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2 Primer(5 μM)，2 μL 模板 DNA,和5.5μL ddH2O。反应参数：95℃预变性5 min；95 ℃ 变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72℃延伸10 min终止。扩增序列通过Illumina MiSeq平台进行Paired-end测序，下机数据经过QIIME（v1.8.0）软件过滤、拼接、去除嵌合体，去除得分低于20分、碱基模糊、引物错配或测序长度小于150 bp的序列。

经过上述步骤后，将标签分组具有97%序列相似性的高质量的OTU序列[6-8]，细菌得到的每个OTU代表序列比对silva数据库和NT数据库，真菌得到的OTU代表序列比对UNITE数据库和NT数据。最后再通过人工进行检查以获得物种信息。稀疏曲线使用R语言绘制来评估微生物多样性。

2 结果与分析

2.1 Alpha多样性分析

计算下沙（XS）、造沙（ZS）轮次Chao1指数以确定物种丰富度，Shannon指数以确定物种多样性，pielou指数反映微生物个体数目分配的均匀程度，以描述堆积、窖内发酵酒醅样品中细菌、真菌群落的多样性。

2.1.1 稀疏曲线分析（图2）

由图2可知，下沙、造沙轮次的样品细菌、真菌稀疏曲线都趋向平坦，说明各样本细菌、真菌的测序数据量合理，测序深度已足够。

2.1.2 Shannon指数、Pielou指数分析（表1）

由表1可看出，下沙、造沙堆积发酵细菌及下沙堆积发酵真菌Shannon指数、pielou指数均高于窖内发酵，说明堆积样品中微生物的多样性及物种均匀程度高于窖内发酵，造沙窖内发酵真菌则反之。也说明了同轮次不同发酵阶段及不同轮次间的微生物多样性存在一定差异。

注：XS：下沙；ZS：造沙；stack：堆积；pit：窖内。

表1 不同发酵过程中酒醅样品Shannon指数及Pielou指数

2.2 不同发酵时期微生物群落多样性结构分析

2.2.1 下沙、造沙轮次细菌分类

对下沙（XS）、造沙（ZS）轮次发酵过程中酒醅样品细菌群落结构在属分类水平上的结果进行对比（相对丰度＜0.1%及未鉴定出的种类归入“其他”），结果见表2。

表2 下沙、造沙发酵过程中酒醅主要细菌群类占比

对酒醅样品中细菌群落的高通量测序结果进行分析，结果发现：下沙、造沙轮次分别检测到203个、184个细菌属。在下沙轮次发酵过程中乳酸菌为丰度最高的细菌，其中Lactobacillus(50.80%)、Weissella(25.08%)、Pediococcus(17.94%)、Lentibacillus(0.92%)、Kroppenstedtia(0.91%)为下沙轮次主要细菌属；造沙轮次发酵过程中乳酸菌同为丰度最高的细菌属，其中Lactobacillus(78.08%)、Pediococcus(6.57%)、Acetobacter(5.91%)、Lentibacillus(2.23%)、Bacillus(2.06%)、Kroppenstedtia(1.52%)、Oceanobacillus（1.42%）为造沙轮次主要细菌属。

2.2.2 下沙、造沙轮次真菌分类（表3）

表3 下沙、造沙发酵过程中酒醅主要真菌群类占比(%)

下沙、造沙轮次分别检测到160个、109个真菌属。在下沙轮次发酵过程中毕赤酵母属为丰度最高的真菌，其中Pichia(84.78%)、Saccharomyces(6.23%)、Thermoascus(1.95%)、Aspergillus(1.45%)、Monascus(0.8%)为下沙轮次主要真菌属；造沙轮次主要真菌属为Pichia(77.71%)、Saccharomyces(13.80%)、Thermoascus(2.65%)、Thermomyces(1.0%)、Aspergillus(0.67%)。

2.3 细菌、真菌的演替规律

2.3.1 下沙、造沙轮次发酵过程中细菌群落的演替规律分析（图3、图4）

图3 下沙发酵过程中细菌群落结构变化

图4 造沙发酵过程中细菌群落结构变化

下沙轮次堆积开始时，酒醅通过网罗大曲和环境获得了丰富的微生物资源，其中Pediococcus acidilactici（27.82%）、Lentibacillus sp.（14.38%）、Thermoactinomyces sanguinis（11.11%）为优势菌，同时还有其他细菌种属，如Weissella paramesenteroides（9.02%）、Oceanobacillus sp.（7.63%）、Bacillus amyloliquefaciens（7.53%）、Oceanobacillus indicireducens（3.41%）、Staphylococcus condimenti（3.33%）、Bacillus sp.（3.09%）、Kroppenstedtia eburnea（2.9%）、Lactobacillus plantarum（1.16%）等。经高温堆积发酵至发酵结束，不同取样位置、堆积时间的微生物相对丰度略有波动，优势菌主要为Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici、Lactobacillus plantarum等乳酸菌，且相对丰度为80%以上。

在窖内发酵初期，细菌群落结构与堆积后期相近，至窖内发酵7 d，菌群结构发生较大变化，Lactobacillus panis相对丰度增至76.21%，占绝对优势地位。窖内发酵结束，Lactobacillus panis丰度回落至51.92%，与Lactobacillus acetotolerans（34.66%）同为优势菌，同时有Pediococcus acidilactici（3.31%）、Lactobacillus plantarum（3.02%）、Lactobacillus pontis（1.93%）、Lactobacillus buchneri（1.47%）等均为乳酸菌。

造沙堆积开始时，Lentibacillus sp.（22.57%）、Bacillus amyloliquefaciens（14.72%）、Pediococcus acidilactici（10.94%）、Oceanobacillus sp.（10.01%）为优势菌，同时还有Thermoactinomyces sanguinis（9.23%）、Oceanobacillus indicireducens（4.15%）、Staphylococcus condimenti（3.02%）、Kroppenstedtia eburnea（3.0%）、Lactobacillus panis（2.22%）、Bacillus kokeshiiformis（2.06%）、Acetobacter ghanensis（1.91%）等。经高温堆积至发酵结束，优势菌主要为Lactobacillus panis、Pediococcus acidilactici、Acetobacter ghanensis，均为产酸微生物，且相对丰度为90%以上。

窖内发酵的细菌群落结构变化较大，发酵初期Lactobacillus panis相对丰度为76.22%，为绝对优势菌，窖内厌氧发酵过程中Lactobacillus panis、Lactobacillus sp.、Lactobacillus acetotlerans呈现升高后降低的趋势，至窖内发酵结束，Lactobacillus sp.（78.62%）、Lactobacillus acetotolerans（16.07%）、Lactobacillus panis（3.86%），乳酸菌成为优势菌，相对丰度为98%以上。

2.3.2 下沙、造沙轮次发酵过程中真菌群落的演替规律分析（图5、图6）

图5 下沙发酵过程中真菌群落结构变化

下沙轮次真菌微生物多样性比较单一，从下沙堆积至窖内发酵结束，Pichia kudriavzevii是绝对优势菌株。堆积0 d至堆积发酵结束，Pichia kudriavzevii相对丰度由41.28%升至91.28%，Saccharo-myces cerevisiae则先升后降至1.63%。窖内发酵阶段真菌群落结构变化不大，到发酵结束，Pichia kudriavzevii（89.56%）、Pichia manshurica（7.74%）为优势菌，Saccharomyces cerevisiae降至1.35%。

图6 造沙发酵过程中真菌群落结构变化

造沙轮次发酵过程中Pichia kudriavzevii在窖内发酵结束降至48.78%，Saccharomyces cerevisiae先升后降至22.32%，Pichia manshurica则升高至14.67%。但整体与下沙轮次发酵过程相比，Pichia kudriavzevii相对丰度下降明显，Saccharomyces cerevisiae与Pichia manshurica均有较大幅度增长。

2.4 不同轮次不同发酵阶段主成分分析（Principal component analysis）（图7、图8）

图7 不同发酵阶段细菌主成分分析

通过主成分分析，将多维变量降维成两个变量进行分析，细菌群落第一主成分（PC1）贡献率达46.1%，第二主成分（PC2）贡献率达27.7%；真菌群落第一主成分（PC1）贡献率达93.1%，第二主成分（PC2）贡献率达4.4%。结果显示，下沙堆积、窖内及造沙堆积、窖内各自聚为一类，说明不同轮次不同发酵阶段菌群结构及微生物多样性存在显著差异（p＜0.05）。

图8 不同发酵阶段真菌主成分分析

3 结论

本研究基于酱香型白酒下沙、造沙轮次酒醅高通量测序结果对其堆积发酵及窖内发酵过程中的细菌、真菌多样性进行了分析。

下沙、造沙分别检测到细菌203个属和184个属，乳酸菌为优势细菌贯穿了下沙、造沙堆积发酵，窖内发酵的整个过程，说明了乳酸菌对酱香型白酒发酵的重要性。在堆积发酵结束，Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici、Lactobacillus panis占比可达80%以上，窖内发酵结束，Lactobacillus panis、Lactobacillus sp.、Lactobacillus acetotolerans占比可达90%以上。而清香型白酒发酵过程中优势乳酸菌比较单一，Lactobacillus fuchuensis相对丰度始终保持在较高的水平[9]；浓香型白酒发酵过程中占绝对优势地位的是Lactobacillus acetotolerans，其在发酵3 d后相对丰度可占整个乳酸菌属98%以上，并持续至发酵结束[10-12]。

下沙、造沙分别检测到真菌160个属和109个属，优势菌属均为酵母菌，下沙期间，Pichia kudriavzevii为绝对优势菌，占比在90%左右，造沙窖内发酵时，Saccharomyce scerevisiae大量繁殖，至窖内发酵结束达到22.32%，Pichia kudriavzevii占比仍达48.78%。下沙、造沙轮次是酱香型白酒的非产酒轮次，酵母菌作用则主要表征在产香及产前体物质方面[13-15]。Saccharomyces cerevisiae是白酒发酵过程中的主要产酒微生物，在不同香型的发酵过程中都不可或缺[16-17]，但其在酱香型白酒造沙窖内发酵期间才大量生长，占比可达20%～40%之间。Pichia kudriavzevii、Pichia membranifaciens、Candida krusei、Zygosaccharomyces bailii等均对酸、醇具有较强酯化能力，产生的物质对酒体风格形成具有重要作用[16，19-23]，其中Pichia kudriavzevii在不同香型白酒发酵过程中的演替规律存在显著差异，在酱香型白酒发酵过程中其相对丰度最高可达95%以上，清香型白酒发酵起始时，Pichia kudriavzevii相对丰度最大(85.12%)，到发酵20 d丰度降至最小(32.85%)，至发酵结束升至43.29%[18]；浓香型白酒占主体地位的主要为Saccharomyces cerevisiae[24-25]。

由此可见，白酒发酵过程中主要微生物菌群结构的差异是造成不同香型白酒差异明显的因素之一，也是酱香型白酒不同轮次间白酒香气成分差异的主要因素。但是目前仍不清楚不同乳酸菌、酵母菌间相互作用对于白酒酿造过程的影响，且酱香型白酒发酵过程中温度、酒醅糊化程度、水分、淀粉、酸度、微生物间相互作用等的变化均为影响微生物生长代谢的环境因素，从而形成不同发酵阶段微生物多样性的差异。因此，后续将在下沙、造沙轮次微生物多样性和演替规律的基础上，进一步结合可培养实验对发酵过程中微生物的功能及相互作用进行研究，为更好地揭示酱香型白酒酿造机理和控制白酒品质提供生物学依据。