葡萄酒乳酸菌发酵剂研究进展

李莹莹，刘　叶

（甘肃紫轩酒业有限公司，甘肃嘉峪关735100）

葡萄酒乳酸菌发酵剂研究进展

李莹莹，刘叶

（甘肃紫轩酒业有限公司，甘肃嘉峪关735100）

苹果酸-乳酸发酵（MLF）是葡萄酒酿造中重要的二次发酵，由乳酸菌（LAB）进行。自发进行的MLF难以控制，越来越多的葡萄酒生产商都选择使用商业化苹果酸-乳酸细菌（MLB）发酵剂进行MLF，因此对MLB发酵剂进行研究具有重要的现实意义。介绍了商业MLB发酵剂的发展概况、种类以及直投式MLB发酵剂。通过对目前研究重点的阐述，指出了MLB发酵剂未来研究的发展方向与创新点。

葡萄酒；MLF；MLB发酵剂

酿酒是葡萄汁到葡萄酒的生物转化过程，酿酒酵母进行酒精发酵（AF），将葡萄汁中的糖转化为酒精和CO2。除了进行酒精发酵，有些葡萄酒还要进行二次发酵，也就是苹果酸-乳酸发酵（MLF）[1]。MLF是葡萄酒进行生物降酸的有效手段，可以提高葡萄酒的稳定性，改善葡萄酒的质量[2]。通常情况下，MLF是由存在于葡萄皮与酒窖中的微生物进行的，发酵时间难以预计，而且结果往往不能使人满意[3]。接种商业苹果酸-乳酸细菌（MLB）发酵剂逐渐成为一种趋势，因为这不仅可以顺利完成MLF，还可以减少自发发酵引起的风险[4]。对微生物来说，葡萄酒是非常恶劣的环境，因此即使使用了商业发酵剂也并不能保证顺利完成发酵[5]。细菌的生长会被很多因素影响，主要是葡萄酒的理化性质和其他微生物的存在。大多数商业MLB发酵剂只含有酒酒球菌，接种这些含有单菌株的发酵剂可以促进葡萄酒快速地启动和完成MLF，并且有助于良好风味的形成。

关于MLB发酵剂，国外研究较早，且已取得了很大的成就。很多性状优良的MLB经过分离、筛选、冷冻干燥，已经制成商业活性MLB，在葡萄酒生产中得到广泛应用。而我国对MLB的分离筛选工作进行的很少，还未能将国内丰富的MLB资源真正开发利用起来。目前，我国多数葡萄酒厂依靠进口活性干乳酸菌或自然发酵进行MLF，从而使生产成本极大增加。所以，充分利用国内资源，筛选适合葡萄酒生产的LAB菌种已成为我国研究人员亟须完成的课题。

1　葡萄酒MLB发酵剂概况

1.1发展历史

1980年，冷冻干燥MLB发酵剂出现，在此之前液体MLB发酵剂使用了几十年，冷冻干燥MLB发酵剂的使用实现了对葡萄酒MLF的控制和预测。1990年，产生了直投式MLB发酵剂。实际生产中，葡萄酒商多用直投式MLB发酵剂进行MLF[6]，因为它不仅满足了生产者的需求，而且提高了葡萄酒的品质，使用起来也更加方便。目前，市面上有各种各样的MLB发酵剂，大多以冻干的形式销售，也有一些是液体形式。

1.2包含菌种

从1960年到1970年，菌株ML34是倡导“使用单一菌株诱导MLF”这一概念的标准菌株。大多数商业MLB发酵剂只含有酒酒球菌，最近的研究着重于将植物乳杆菌也应用于商业发酵剂的生产中。有研究者从巴塔哥尼亚葡萄酒中分离出植物乳杆菌进行MLF，结果表明，有2株具有作为巴塔哥尼亚葡萄酒MLB发酵剂的潜力[7]。

1.3菌株筛选标准

发酵剂中的MLB菌株筛选自自发进行MLF的葡萄酒，它们在葡萄酒中都有很好的发酵特性。商业MLB发酵剂具有非常高的活菌数（约1011cfu/g），这样才能确保在葡萄酒中具有足够强的生存能力。要筛选出能够在恶劣葡萄酒环境中生长的菌株，需要制定严格的筛选标准。前期的研究人员已经制定了严格的MLB发酵剂菌株的筛选标准[8]。主要包括下面几方面：耐低pH值、高浓度乙醇和SO2，在葡萄酒中具有良好的生长特性，与酿酒酵母有良好的兼容性，在生产过程中存活率高，不产生生物胺，不产生不良风味[9]，产生芳香成分，有利于葡萄酒风味的构成。

1.4国内MLB发酵剂发展现状

酒酒球菌SD-2a是西北农林科技大学葡萄酒学院自行选育，并于2002年获得国家专利的1株优良酒酒球菌。有较强的耐酒精能力，嗜酸，生长于pH 3.5～3.8的葡萄汁和果酒中，10%vol乙醇不抑制其生长。对低pH值、较高浓度SO2也有较好抗性，具有较快的MLF速率和较强的降酸能力。用SD-2a进行MLF的葡萄酒样挥发酸升高值较低且稳定。酒酒球菌SD-2a的精氨酸代谢特性良好，不会过多降解精氨酸、产生脲、瓜氨酸等前体物质，而且不会导致致癌物质氨基甲酸乙酯的过量合成[10]。用该菌种进行MLF后的干红葡萄酒口感柔和、润口、协调，香气浓郁，结构平衡，酒质明显提高[11]。但是目前，我国MLB发酵剂的制备技术还不是很完善，细胞存活率低、保存时间短，特别是工业化生产技术还未开发出来。因此，国内还没有厂家生产商品化的MLB发酵剂。罗华对SD-2a进行了高密度培养条件及冻干保护剂配方优化[12]。黄科建立SD-2a活性干粉生产HACCP体系，并对SD-2a干粉进行品质测定。张如金对SD-2a活性干粉的生产工艺参数及生产性能进行了进一步的研究，这些研究为酒酒球菌SD-2a活性干粉的工业化生产和推广奠定了基础[13]。此外，刘凯研究了昌黎产区的越千年干红葡萄酒中分离出的60株MLB。通过酒精和酸耐性试验表明，酒酒球菌C10和J2可以在模拟葡萄酒环境中生长（pH3.0，乙醇14%vol）。这2株菌株的苹果酸降解率分别是每天430.625mg/L和76.994mg/L。研究表明，酒酒球菌C10和J2具有作为MLB发酵剂的潜力[14]。

2　商业MLB发酵剂种类和使用方式

商业MLB发酵剂主要有3种不同的形式：液态（liquid）、冷冻态（frozen）以及冻干粉（lyophilised）。液体悬液的保质期短，使用前需要3～7 d的准备时间。需要用不含SO2的葡萄汁活化，葡萄汁的总糖水平要调节到180g/L。如果没有葡萄汁，也可以用已经完成MLF的葡萄酒（50%vol的总SO2小于10mg/L的葡萄酒、25%vol的水和25%vol的苹果汁）活化，用碳酸钙调整pH3.5～3.6，培养温度在22～26℃。冷冻发酵剂也需要在室温下用葡萄汁（3 L水，3 L葡萄汁和30g酵母提取物）活化。用碳酸钙或其他缓冲液调整pH4.0，并充分混匀。加入170g已经解冻的发酵剂，密封并充分混匀，18～24℃培养48 h后接种。冻干发酵剂需要在葡萄酒与水比例为1∶1的混合溶液中活化，培养3～14 d后再添加到葡萄酒中，要求活化所用的葡萄酒pH值大于3.3，总SO2小于30mg/L。活化过程中，监控苹果酸下降，大约2/3苹果酸转化为乳酸时，以体积分数5%的接种量接种到葡萄酒中。

3　直投式MLB发酵剂

直投式MLB发酵剂也是冻干发酵剂，但是使用更加方便，可以不经活化直接加入到需要进行MLF的葡萄酒中。直投式MLB发酵剂是目前葡萄酒发酵工业的一个研究热点，其具有以下优点：活菌数高(1010～1012cfu/g)、活力高、接种量少、保质期长、产品质量稳定。直投式MLB发酵剂不需要经过活化、扩培等预处理而直接应用于生产，大大提高劳动生产率与产品质量[15]，同时减少发酵工业的生产成本与生产周期。首次用于直投的葡萄酒MLB发酵剂生产于1993年，现在已经在酿酒过程中广泛应用。商业直投发酵剂中的细菌在培养过程中经过胁迫和驯化，在投入葡萄酒后可以更好地耐受恶劣环境。并不是所有的菌株都可以存活于驯化过程。事实上，分离到的MLB只有很少一部分可以被应用于这个生产工艺。菌株有可能因为长势弱、ML酶活性低、或者不能幸存于这个过程而被淘汰。最后存活的菌株都是健壮的、有能力完成MLF的、可以生产出高质量葡萄酒的菌株。这些MLB发酵剂可以直接添加到葡萄酒中，某些在加入葡萄酒之前需要进行短时间的简单活化，这样可以使细菌均匀分布在酒中。

4　未来MLB发酵剂发展趋势

4.1新型MLB菌株的筛选

酒酒球菌是商业MLB发酵剂包含的主要菌种，乳杆菌和片球菌也可以进行MLF，但不能发酵完全[16]。有17种不同的乳杆菌和酿酒有关，有些和葡萄有关，有些和葡萄酒AF以及MLF有关[17]。最近的实验表明植物乳杆菌可以有效进行MLF，并可以使红葡萄酒产生令人满意的香气特征[18]。有害片球菌也可以进行MLF，将商业酒酒球菌发酵剂接种到Caino白葡萄酒中进行MLF，用HPLC定量苹果酸和乳酸，结果表明，本地有害片球菌可以优于商业酒酒球菌占主导地位，可以在Caino白葡萄酒中进行MLF，并使酒体更加成熟[19]。此外，使用从本地区葡萄酒微生物区系中筛选的菌株来进行MLF是很有利的，因为菌株对葡萄酒环境有着天然的适应能力，同时也保证了区域葡萄酒的特点[20]。

4.2MLB菌株的改良

可以通过基因重组对MLB菌株进行基因改良。一般是对目标MLB外源基因的表达或基因超表达或有害基因的去除。这通常需要导入载体质粒，但是酒酒球菌不像其他乳酸菌，质粒转化很困难，极少成功[21-22]。另一种外源基因表达的方法是噬菌体转导，尽管噬菌体有可能导致MLF失败，但对酒酒球菌来说这种方法理论上也是可行的，但是目前转导机制还不是很清楚，需要进一步的研究。还有一种基因改良的方法是转座子，问题是当前的结合方法不能够使酒酒球菌基因置换，因为转移频率远远低于重组频率[23-24]。尽管基因去除或表达都是很有益的，但是把这些技术运用到酒酒球菌很困难。因此对胁迫相关单个基因的鉴定是很重要的。例如MLF中抵抗胁迫的基因涉及到多位点的多基因，并且广泛分布在基因组，使得目标基因的操控高度复杂。影响MLF的主要胁迫因素之间不仅在物理水平相互作用，还潜在于基因水平。如果仅仅提升菌株抵抗某种胁迫的能力，有可能会使抵抗其他胁迫的能力受到不利影响。

通过非重组来改良菌株用于工业生产也是不错的选择，目前这种方法得到越来越多的重视。其中之一就是定向进化（DE），也叫适应进化，已经成功地运用于乳杆菌[25-28]。定向进化是对种群全基因组进行操控并使多样化，不需要对全基因组有深入的了解。DE的前提是微生物体在连续的胁迫环境下会逐渐适应环境。有利于个体生长并繁殖的突变使菌株在胁迫环境下逐渐增长，这样就能被筛选出来[29]。酒酒球菌是快速进化的个体，而葡萄酒又具有很强的抑制作用，这使得定向进化成为改良酒酒球菌菌株的很好的方法。但是，目前对酒酒球菌定向进化的过程还没有完全了解，因此需要进一步的研究。

4.3不同的菌株用于生产不同的酒

根据不同的葡萄酒的类型和特点来选择适合的菌株。多年来，MLF被认为是简单的L-苹果酸脱羧为L-乳酸和CO2。Henick-K ling描述了MLB的代谢活性以及对葡萄酒香气组分的影响[30]。Richardson报道了单个MLB菌株对葡萄酒具体香气的贡献。某些菌株产生特征性的黄油味、酵母味以及坚果香气，而另一些菌株可以赋予葡萄酒果香并减少生青味。MLB发酵剂将会以其对葡萄酒整体香气轮廓的感官贡献为特征，特定的MLB发酵剂将会有助于生产具有特定香气的葡萄酒。

4.4诱导MLF的新技术

近年来的研究提出利用一些新技术来诱导MLF，如固定化细胞或者酶技术[31]。使用高密度的固定化细胞来进行MLF在一定程度上可以抵抗高乙醇和低pH对菌体的伤害，并且细胞可以循环利用。目前主要有2种固定化方法，细菌细胞的包装[32-33]和附着/吸附在支撑物上[34-35]。

包埋入Lentikats®基质中的酒酒球菌细胞在14%vol乙醇以及低酸条件下苹果酸降解率都增加。对于用此方法固定细胞进行MLF对葡萄酒组分和感官特性的整体影响，需要进一步的研究来确定。大量的研究报道了使用游离或固定化的MLB进行MLF，而使用游离或固定化M leA酶进行直接的生物转化几乎不曾被研究。有可能是因为这个过程需要锰（Mn+）和NAD+作为辅酶因子[36]。和游离酶相比，固定化酶在适应环境上更强和稳定[37]。但M leA酶活性最优的pH值是6.0，并且反应体系需要NAD+，这都需要进一步的研究来解决。

5　小结

为了使葡萄酒更好地进行MLF，接种商业化MLB已经成为一种趋势。市面已经有各种类型的MLF发酵剂在售，可以满足不同类型葡萄酒的香气和口感需求。另外，近些年随着分子生物学和酶技术的快速发展，MLB菌种改良和一些诱导MLF的新技术也将变成可能。与此同时，我国也要积极开展本土优良MLB菌种的筛选、冻干保护剂配方以及冷冻干燥工艺优化的相关研究，从而生产出拥有自主知识产权的MLB发酵剂，解决我国MLF发酵剂目前全部依赖进口的问题。这既有利于提高我国葡萄酒产品的质量，又有利于节约成本，提高了我国葡萄酒企业的国际竞争力。

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Research Progress in Lactic Acid Bacteria Fermenting Agent forgrapeW ine

LIYingying and LIU Ye
（ZixuanWinery Co.Ltd.,Jiayuguan,Gansu 735100,China）

Malic acid-lactic acid fermentation(MLF)is the important secondary fermentation performed by lactic acid bacteria in the production ofgrape w ine.Spontaneous MLF is hard to control.Accordingly,more and more w ineries use commercial MLB fermenting agent for MLF.The study of MLB fermenting agentwasof importantsignificance.In this paper,the developmentstatusof commercialMLB fermenting agents,their varieties,and direct-inputMLB fermenting agentswere introduced.The developmentdirections and the innovative points ofMLB fermenting agents in the futurewere discussed.

grapew ine;MLF;MLB fermenting agent

TS262.6；TS261.4

A

1001-9286(2016)11-0100-04

10.13746/j.njkj.2016234

2016-07-22

李莹莹(1990-)，女，硕士研究生。

优先数字出版时间：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.1021.007.htm l。