野生毛葡萄皮渣花色苷提取工艺研究

管敬喜，杨　莹，张　劲，成　果，韦芳齐，谢林君，谢太理，文仁德

（广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁530007）

野生毛葡萄皮渣花色苷提取工艺研究

管敬喜，杨莹，张劲，成果，韦芳齐，谢林君，谢太理，文仁德

（广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁530007）

以野生毛葡萄发酵后的皮渣为原料，采用溶剂浸提法提取花色苷。通过单因素试验和正交试验，确定了毛葡萄皮渣花色苷提取的最佳条件：pH1.0，料液比为1∶30，乙醇浓度60%vol，浸提温度60℃，浸提时间60 min。获得的毛葡萄皮花色苷粗品色价为5.96。

毛葡萄； 皮渣； 花色苷； 提取

毛葡萄（V.quinquangularis Rehd）别名为绒毛葡萄、五角叶葡萄，是我国分布最广的野生葡萄种类之一，主要分布在长江以南地区［1］。在广西，毛葡萄较集中分布在桂中、桂北、桂西的喀斯特地貌地区，野生资源蕴藏量十分丰富［2］。毛葡萄果实糖低、酸高、色深，单宁较高，含多种维生素，各种氨基酸、矿物质等营养物质，具有良好的酿造加工性状，可以酿造优质的干红葡萄酒、利口酒，也用作其他葡萄酒的调色、调酸［3-4］。

葡萄酒酿造之后的葡萄皮渣中含有大量的花色苷类物质，其不仅色泽鲜艳，染色优良，还具有改善肝脏、防御身体过氧化、防止动脉硬化以及提高视力等生理功能，是一种重要的天然食用色素和理想的食品添加剂，因而受到越来越多的关注［5-6］。

本实验以野生毛葡萄皮渣为原料，通过单因素及正交试验，对毛葡萄皮渣花色苷提取工艺进行了初步研究，以期为野生毛葡萄的综合开发利用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

野生毛葡萄皮渣：广西罗城葡萄酒厂。

野生毛葡萄皮渣粉制备：将收集的野生毛葡萄皮渣在60℃烘干，粉碎，过80目筛，得到毛葡萄皮渣粉，置于-20℃下低温保存。

1.2试剂

蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸等试剂，均为分析纯。

1.3主要仪器及设备

UV-1801紫外/可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司），HH-S4数显恒温水浴锅（江苏金怡医疗仪器厂），FA1104N万分之一电子分析天平（上海明桥精密科学仪器有限公司），SHZ-（Ⅲ）型循环水真空泵（河南予华仪器有限责任公司），RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），ALPHA1-2 LD真空冷冻干燥机（德国Martin Christ公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.4实验方法

1.4.1毛葡萄皮花色苷的提取工艺

称取2 g干燥的毛葡萄皮粉末，加入适量的提取溶剂，在一定条件下于水浴锅中恒温提取，真空抽滤，离心（3000 r/min、10 min），得到提取液，再用pH示差法进行花色苷含量的测定。

1.4.2花色苷含量的测定［7］

采用pH示差法。取2.5 mL花色苷色素粗提液，分别用pH1.0、pH4.5的缓冲溶液定容至25 mL，平衡20 min后以缓冲液为对照，在520 nm及700 nm波长下测定其吸光度，根据以下公式计算出花色苷含量：

A=（A520-A700）pH 1.0-（A520-A700）pH 4.5；

花色苷含量（mg/g）=（A×449.29×DF×V）/（26900×m×1）。

式中：449.29是矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔质量（g/mol）；DF是稀释倍数；V是提取液的体积（mL）；26900是矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数（L·mol/ cm）；m是毛葡萄皮粉末质量（g）；1是比色皿的光路长度（cm）。

1.4.3提取率的计算［8］

称取5 g毛葡萄皮粉于锥形瓶中，用试验确定的最佳条件进行提取，减压浓缩，初步纯化，然后进行冷冻干燥，称取干燥后的样品，计算提取率，产品的提取率按下式计算：

W=花色苷粉质量（g）/毛葡萄皮粉末质量（g）×100%。

1.4.4花色苷粉末色价的测定［9-10］

准确称取1 g纯化后的花色苷粉末，用pH3.0的柠檬酸缓冲液溶解并定容到100 mL的容量瓶中，再用缓冲溶液进行适当稀释，使ABS在0.2～0.8之间。用1 cm的比色皿以缓冲液做空白，在520 nm处测定吸光值。

产品的色价Ecm%=A×稀释倍数。

1.4.5毛葡萄皮渣花色苷提取单因素试验设计

（1）料液比对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响。在提取液乙醇浓度40%vol，提取液pH1.0，提取时间60 min，提取温度50℃的条件下，料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50下提取毛葡萄皮中的花色苷。

（2）pH值对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响。在提取液乙醇浓度40%vol，提取时间60 min，料液比1∶30，提取温度50℃的条件下，于pH0.5、pH1.0、pH2.0、pH3.0、pH4.0下提取毛葡萄皮中的花色苷。

（3）乙醇浓度对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响。在提取液pH1.0，提取时间60 min，料液比1∶30，提取温度50℃的条件下，用乙醇浓度0%vol、20%vol、40%vol、60%vol、80%vol、95%vol的提取液提取毛葡萄皮中的花色苷。

（4）温度对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响。在提取液乙醇浓度40%vol，提取液pH1.0，提取时间60 min，料液比1∶30的条件下，提取温度分别为35℃、50℃、65℃、80℃下提取毛葡萄皮中的花色苷。

（5）提取时间对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响。在提取液乙醇浓度40%vol，提取液pH1.0，料液比1∶30，提取温度50℃的条件下，于提取时间30 min、60 min、90 min、120 min、150 min下提取毛葡萄皮中的花色苷。

1.4.6毛葡萄皮渣花色苷提取正交试验设计

根据单因素试验的结果，以乙醇浓度、提取温度、提取时间3个因素为研究对象，分别设3个水平，按L9（34）正交表进行正交试验，优化野生毛葡萄皮花色苷的提取工艺，确定最佳提取工艺参数。正交因素水平见表1。

表1　正交试验的因素水平

1.4.7数据处理

利用DPS7.05和Origin8.5软件对数据进行分析和作图。

2　结果与分析

2.1检测波长的确定（图1）

图1　毛葡萄皮花色苷光谱图

取少量花色苷提取溶液在200～700 nm波长范围内进行检测，得其吸收光谱（见图1），结果显示，提取液在可见光区520 nm处有最大吸收峰，因此选定520 nm作为测定毛葡萄皮花色苷的最大吸收波长。

2.2毛葡萄皮花色苷提取单因素结果分析

2.2.1料液比对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响（图2）

图2　料液比对毛葡萄皮花色苷提取的影响

从图2可知，随着料液比的增大，提取液中花色苷的含量逐渐增加。料液比的增加能提高分子扩散速率、缩短浓度平衡时间，使溶解在提取液中的花色苷增多，因而增加了提取量［11］。同时从图2还可以看出，当料液比大于1∶30时，花色苷含量增加的幅度相对来说不明显，考虑到成本和经济性，因此选择1∶30为提取液的最佳料液比。

2.2.2pH值对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响（图3）

图3　pH值对毛葡萄皮花色苷提取的影响

由图3可知，随着提取液pH值的逐渐上升，提取液中花色苷的含量逐渐降低，当提取液pH0.5时，花色苷的含量最大。pH值对色素提取率的影响很大，在强酸性介质中，色素的提取率较高，色泽鲜艳、纯正，说明提取液中较强的酸性有利于毛葡萄皮渣中花色苷物质的浸出。随着pH值上升，花色苷结构发生变化，裂解为花色素基元及糖基两部分，导致花色苷稳定性下降；而提取剂的pH值过低可能使花色苷的糖基水解，也会导致花色苷的稳定性下降而发生降解［12-13］，因此综合考虑提取液的适宜pH1.0。

2.2.3乙醇浓度对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响（图4）

图4　乙醇浓度对毛葡萄皮花色苷提取的影响

从图4可知，乙醇体积分数对提取效果影响较为显著，随着乙醇浓度的增加，提取液中花色苷的含量也逐渐增加，乙醇浓度为60%vol时，花色苷含量达到最大值，但伴随着乙醇浓度的继续增加，花色苷的含量反而逐渐下降，这可能是因为随着乙醇浓度的增加，提取剂的极性发生了变化［14］，因此选择提取液乙醇浓度控制在60%vol。

2.2.4提取温度对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响（图5）

图5　温度对毛葡萄皮花色苷提取的影响

从图5可以看出，在65℃时，随着提取温度的升高，提取液中花色苷的含量逐渐增加，但在80℃时，花色苷的含量下降许多。适当升高提取温度有助于提高提取液中毛葡萄花色苷的含量，但由于花色苷耐热性较差，高温易分解，因而提取温度过高时，花色苷提取率反而降低。考虑到升高温度会增加能耗，使得生产成本提高，不利于实际生产应用［15］，因此选择50～65℃为宜。

2.2.5提取时间对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响（图6）

图6　提取时间对毛葡萄皮花色苷提取的影响

从图6可知，在120 min内，随着提取时间的延长，提取液中花色苷的含量逐渐增加，120 min提取液中花色苷含量达到最大值，150 min时花色苷含量反而降低，60 min、90 min、120 min与30 min、150 min在花色苷含量上相比，具有显著的差异。随着提取时间的延长，提取率不断提高，然后提取率平稳下降。原因是色素不稳定，随着提取时间的延长，花色苷会因氧化反应导致分解而退色，生成无色的查尔酮结构，使其含量降低［16］，因此时间范围选择60～120 min。

2.3毛葡萄皮渣花色苷提取工艺的正交试验设计结果及分析（表2、表3）

根据表2的计算结果可知，乙醇浓度、提取温度、提取时间的极差分别为0.2374、0.1048、0.1905，各因素对毛葡萄皮渣中花色苷提取的影响主次顺序为乙醇浓度＞提取时间＞提取温度；由试验数据分析得出的最佳工艺条件为B2C2D1，即料液比为1∶30，提取液pH1.0，乙醇浓度60% vol，提取温度60℃，提取时间60 min。在该提取条件下通过验证试验，提取液中花色苷含量平均为1.9044 mg/g。

2.4毛葡萄皮花色苷初步纯化及其提取率计算

为了能够进一步获得提取的毛葡萄皮花色苷制品，对提取液进行减压浓缩，然后向花色苷浓缩液中加入2倍体积的乙酸乙酯，分层后收集水相部分，以相同方法将水相部分萃取2次，得到初步纯化的花色苷水溶液，再使用AB-8大孔树脂对花色苷溶液进行纯化［17］（湿法装柱（15 mm×400 nm），柱高30 cm，以流速1 mL/min进样，待达到吸附饱和时（即流出液浓度与上样液浓度相同时），用2BV蒸馏水洗去杂质，再用9BVpH值2.0、体积分数为70%vol的乙醇溶液以相同流速洗脱，收集洗脱液），将上述洗脱液置于冷冻干燥机，冻干24 h，得到纯化后的花色苷粉末。

表2　正交试验设计结果和分析

表3　验证试验结果

用该方法得到的花色苷粉产品提取率为5.84%～6.24%，获得的花色苷粉制品色价为5.96（表4）。

表4　提取率结果

3　结论

通过单因素试验探讨了料液比、pH值、乙醇浓度、浸提温度、浸提时间等因素对毛葡萄皮花色苷提取效果的影响。并在单因素的基础上进行正交优化试验，确定了毛葡萄皮花色苷提取工艺的最佳条件，即pH1.0，料液比为1∶30，乙醇浓度60%vol，浸提温度60℃，浸提时间60 min。通过乙酸乙酯萃取，大孔树脂初步纯化及冷冻干燥获得粗花色苷粉，色价为5.96。

毛葡萄属于东亚种群，不同于欧亚种酿酒葡萄，毛葡萄果皮中含有较多的花色素双糖苷［2-3，18］。本试验仅对野生毛葡萄皮花色苷提取方法进行了研究，对其稳定性和生理活性尚需进一步研究。

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Extraction of Anthocyanins from Wild V.quinquangularis Rehd Skin Residues

GUAN Jingxi，YANG Ying，ZHANG Jin，CHENG Guo，WEI Fangqi，XIE Linjun，XIE Taili and WEN Rende
（Viticulture and Wine Research Institute，GuangxiAcademy ofAgricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China）

Wild V.quinquangularis Rehd skin residues after the fermentation was used as the raw materials for anthocyanin extraction by solvent extraction method.Through single factor and orthogonal experiments，the optimum extraction conditions were determined as follows: pH1.0，the ratio of raw materials and solution was 1∶30，the concentration of ethanol was 60%vol，extraction temperature was at 60℃，and extraction time was 60 min.The color value of the obtained rude anthocyanin powder was 5.96.

wild V.quinquangularis Rehd；skin residue；anthocyanin；extraction

TS261.9

A

1001-9286（2016）08-0040-04

10.13746/j.njkj.2016112

广西农业科学院科技发展基金项目（桂农科2014JQ05）；广西农业科学院基本科研业务专项（桂农科2015YT85）；广西农业科学院基本科研业务专项（桂农科2015YM05）。

2016-04-05

管敬喜（1981-），男，助理研究员，硕士，研究方向为葡萄酒酿造技术。

文仁德（1957-），男，研究员，学士，研究方向为葡萄栽培与管理。

优先数字出版时间：2016-05-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160526.0951.001.html。