大曲中高产纤维素酶菌株的选育及其在绵柔型白酒丢糟中的应用

杨建梅，王晓慧，王永伟，罗　霞

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

大曲中高产纤维素酶菌株的选育及其在绵柔型白酒丢糟中的应用

杨建梅，王晓慧，王永伟，罗霞

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

从大曲中筛选出了1株产纤维素酶能力较强的菌株，并通过连续诱变，获得了1株高产纤维素酶诱变菌株RY49，利用RY49制备功能性纤维素酶帘子曲，与糖化酶、TH-AADY共同应用于绵柔型白酒丢糟中进行入池二次发酵产酒，其出酒率（60%vol糟酒/100 kg丢糟）达到了3.89%，有效提升了丢糟的经济价值。

高产纤维素酶； 菌株； 诱变； 丢糟； 功能性帘子曲； 糖化酶； TH-AADY； 白酒

大曲中微生物种类丰富，数量繁多，主要有霉菌、酵母菌、细菌及放线菌四大类，其中以霉菌居首。在霉菌中，能产纤维素酶的菌类在发酵工业中也是一种较为重要的菌种，本实验从大曲中采集多份样品，以羧甲基纤维素钠为唯一碳源，采用水解圈法，旨在能筛选出1株分泌纤维素酶良好的丝状真菌，以此进一步采用化学诱变方法，以甲基磺酸乙酯（EMS）为诱变剂，经过刚果红平板初筛和发酵测定酶活复筛，以期选育出1株产酶活较高的诱变菌株。

绵柔型大曲白酒在生产中会形成一定量的丢糟，丢糟中一般含有残留淀粉9%～12%，一般酒企将丢糟直接廉价出售，这样导致了丢糟中残留淀粉的浪费。本实验从丢糟残留淀粉入手，利用选育的高产纤维素酶菌株制备功能性纤维素酶帘子曲，同时添加一定量的糖化酶和TH-AADY，进行丢糟入池二次发酵产酒，进一步降低残留淀粉，提高丢糟的经济价值，本实验旨在为丢糟再利用提供具有可行性的参考。

1　材料及方法

1.1材料及试剂

1.1.1材料

糖化酶，50000 U/g，无锡市雪梅酶制剂公司；安琪TH-AADY；麸皮；大曲，取自洋河酒厂；绵柔型丢糟，取自洋河酒厂。

1.1.2试剂

无水乙醇，羧甲基纤维素钠，3，5-二硝基水杨酸，刚果红，硝酸钠，葡萄糖，氯化钾，磷酸氢二钾，硫酸亚铁，硫酸镁，琼脂，氯霉素，氯化钠，蔗糖，酒石酸钾钠，氢氧化钠，无水亚硫酸钠，柠檬酸，柠檬酸钠，土豆。

1.2实验方法

1.2.1高产纤维素酶菌株的选育及其功能性帘子曲制备

1.2.1.1本研究采用以下工艺

大曲取样→初筛→复筛→纤维素酶高产菌→连续诱变→突变菌株→传代试验稳定性→斜面保藏→种曲培养→帘子曲培养制备

1.2.1.2工艺要点

（1）大曲采样：从曲房中抽取30份大曲样品，分别装入无菌袋中，并储存于4℃冰箱中备用。

（2）初筛：将所采样品每份称取5 g，在无菌条件下加入装有45 mL无菌水的三角瓶中（其中三角瓶中装有数粒玻璃珠），将三角瓶置于摇床上振荡2 h，使其中的孢子充分振荡打散后，静置数小时，取上清液用无菌水稀释，将稀释度为10-3、10-4、10-5、10-6的样品分别吸取0.2 mL涂布于准备好的初筛平板上，倒置培养7 d，将初筛平板中的霉菌挑取到察氏培养基上进行划线分离，得到单菌落，将纯化后的霉菌点接到初筛培养基上，进行刚果红实验。

（3）刚果红实验步骤：待所点菌种在CMC平板上长出可见菌落后，往平板里加入适量1 mg/mL的刚果红溶液，染色1 h后，弃去染色液，并同时用蒸馏水清洗，最后加入适量1 mol/L的NaCl溶液，脱色1 h，观察水解圈直径与菌落直径的大小。

（4）复筛：将初筛的菌株发酵产酶，测得粗酶液的滤纸酶活和CMC酶活，最终以酶活值为标准筛选出纤维素酶高产菌株。

（5）霉菌孢子的获得：将选育出的纤维素酶高产菌株转接到察氏培养基平板上，28℃恒温培养5～6 d，待平板上长出大量孢子后，用无菌水将孢子洗下，并用无菌脱脂棉过滤除去菌丝，将孢子悬浮液过滤到加有玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡30 min，保证90%以上的孢子为单孢子，显微镜下观察，血球板计数，调节孢子浓度至106个/mL。

（6）甲基磺酸乙酯（EMS）诱变：吸取1 mL已调节好浓度的孢子悬浮液于无菌离心管中，5000 r/min离心5 min收集孢子，用1 mL无菌水同样条件离心洗涤1次，离心后悬浮孢子于1 mL无菌磷酸缓冲液（pH7.0）中，分别加20 μL、30 μL、40 μL、50 μL和60 μL EMS原液，振荡分散孢子，分别置于28℃摇床中振荡90 min，然后5000 r/min立即离心5 min，弃上清液，用5%Na2S2O3离心洗涤2次终止反应，再悬浮孢子于1 mL无菌水中，稀释到10-4，吸取0.2 mL稀释液涂布于察氏培养基平板上，28℃培养3～4 d。

（7）EMS连续诱变：出发菌株经EMS诱变后，经初筛、复筛后选育出1株产酶活高的诱变菌株，然后再次以该诱变菌株为出发菌株，进行下一轮的EMS诱变，按同样的方法进行初筛、复筛。

（8）突变菌株传代实验：将选育得到的高产纤维素酶突变菌株依次传代5代培养，按上述方法依次测定每代菌株的酶活，考察传代次数对诱变菌株产酶性能的影响。

（9）种曲培养：培养基配方为谷草粉60%，麸皮40%，加2.5倍水拌匀后，0.1 MPa蒸汽灭菌30 min，冷却后接种斜面保藏的高产纤维素酶菌种，于32℃条件下培养5 d。

（10）功能性帘子曲培养制备：培养基配方为谷草粉70%，麸皮30%，加2倍的营养盐溶液。营养盐溶液组分为：NaNO31.5%，（NH4）2SO40.8%，（NH4）2HPO40.2%，MgSO40.05%，经常压蒸汽蒸煮1 h后，含水量为70%，物料冷却后接入按（9）方法培养的种曲2%，拌匀后置于竹帘上，料层厚度为2.5 cm，于30～32℃下培养3～4 d即可。

1.2.2高产纤维素酶菌株在丢糟中的应用

1.2.2.1本部分采用以下工艺

新鲜丢糟→摊晾→喷洒糖化酶液→拌匀、摊晾→撒功能性纤维素帘子曲粉→拌匀、摊晾→喷洒TH-AADY活化液→拌匀→入窖发酵→出窖→蒸酒

1.2.2.2工艺要点

（1）糖化酶液的制备。将糖化酶按照1∶10的比例加入30℃的温水溶解即可，需现用现配，以免时间太长失活。

（2）TH-AADY活化液。将TH-AADY用灭菌后的2%的葡萄糖溶液溶解，置于30～32℃保温室中活化2 h备用。

（3）入窖发酵。将蒸酒结束后的丢糟摊晾至57～62℃，均匀喷洒糖化酶液，用量依照200～300 U/g淀粉添加，拌匀摊晾至47～52℃，撒入功能性纤维素酶帘子曲粉，用量为1.0～2.0 kg/100 kg丢糟，继续拌匀摊晾至28～31℃时，撒入TH-AADY活化液，TH-AADY使用量为1‰～2‰，拌匀后入窖发酵。

（4）发酵与蒸酒。发酵至15 d后，即可出窖蒸酒。蒸酒要按照“掐头去尾”原则，蒸酒过程中控制好流酒温度及流酒速度。

1.3分析、测定方法

纤维素酶活测定法：包括CMC酶活及滤纸酶活，采用DNS法；菌落数测定法：平皿培养法；酒精度测定：比重法；总酸总酯测定：滴定法；淀粉测定法：DNS法；糟酒主要成分测定法：气相色谱法。

2　结果与分析

2.1高产纤维素酶菌株的选育

2.1.1大曲中初筛结果

经过多次筛选工作，本实验从30份大曲样品中共挑取106株菌，将其进行分离纯化后，通过刚果红实验分别观察其水解圈的大小及清晰程度，最后从106株菌中筛选出36株（编号为1#—36#）进行下一步的复筛工作。部分初筛菌落见图1，产纤维素酶菌株在刚果红平板上所形成的水解圈见图2。

图1　部分初筛菌落

图2　产酶菌株在刚果红平板上的水解圈

2.1.2复筛结果

将通过刚果红平板初筛出的36株菌发酵后测定滤纸酶活以及CMC酶活大小，其结果见表1。

表1　产纤维素酶菌株酶活

通过初筛与复筛，获得了1株产纤维素酶能力较高的菌株，编号为18#，将此菌株通过进一步诱变以提高其产酶能力。

2.1.3EMS浓度对菌株致死率的影响

根据1.2.1.2中（6）实验方法分别用浓度为20 μL/mL、30 μL/mL、40 μL/mL、50 μL/mL和60 μL/mL的EMS原液，处理18#孢子悬浮液90 min，经稀释适当浓度后涂布在察氏培养基上培养计数，所得致死率结果见图3。

图3　EMS处理浓度对孢子致死率的影响

由于诱变菌株有正突变株和负突变株，一般认为致死率在70%～80%的平皿获得正突变菌株的机率最高。由图3可知，EMS处理浓度为40 μL/mL时的致死率在此范围内，因此确定EMS诱变该菌株的最佳条件为：在pH7.0磷酸缓冲液条件下，EMS浓度40 μL/mL，处理时间90 min。

2.1.4出发菌株与诱变菌株刚果红平板图（图4）

图4　出发菌株与诱变菌株的刚果红平板实验图

2.1.5第一轮初筛结果

18#按1.2.1.2中（6）实验方法经EMS诱变后从初筛平板上共挑出70株菌，依次将其点接到CMC平板上，分别测定其“水解圈直径/菌落直径”比值。通过刚果红实验，共获得8株菌，其“水解圈直径/菌落直径”比值比出发菌株提高25%。

2.1.6第一轮复筛结果

将2.1.5初筛出的8株菌进行发酵产酶测酶活，其结果见表2。

表2　第一轮复筛结果

18#经诱变后，经刚果红平板筛出的8株菌经发酵后测定酶活，滤纸酶活提高幅度最大的是Y39，提高幅度为58.5%；CMC酶活提高幅度最大的是Y52，提高幅度为42.1%，但综合考虑滤纸酶活与CMC酶活，选取Y31作为下一轮诱变的出发菌株。

2.1.7第二轮初筛结果

Y31按1.2.1.2中（6）实验方法经EMS再次诱变后，从初筛平板上共挑取87株诱变菌株，依次进行刚果红平板实验，根据水解圈大小情况，共选出10株进行下一步的发酵产酶复筛。

2.1.8第二轮复筛结果

将2.1.7初筛出的10株菌进行发酵产酶测酶活，其结果见表3。

表3　第二轮复筛结果

Y31经EMS再次诱变后，通过初筛挑出的10株菌中，滤纸酶活提高幅度最大的是RY67，比出发菌株提高了35.6%；CMC酶活提高幅度最大的是RY25，比出发菌株提高了41.6%，综合考虑滤纸酶活与CMC酶活，诱变效果最好的为RY49，其滤纸酶活和CMC酶活分别比出发菌株提高了24.8%、35.9%。将RY49作为本实验最终选育的高产纤维素酶的诱变菌株，进行下一步研究利用。

2.1.9诱变菌株传代实验

诱变菌株必须具有较为稳定的遗传稳定性，才具有实际应用价值。为了测定传代次数对诱变菌株RY49产纤维素酶性能的影响，将该诱变菌株在察氏平板上传代培养。由图5可以看出，当传代次数在5次之内时，酶活的变化较小，随着传代次数的增加，酶活略有下降，说明传代次数对该诱变菌株产酶性能的影响不大。

图5　传代次数对诱变菌株酶活的影响

2.2RY49在绵柔型丢糟中的应用

2.2.1丢糟入池二次发酵前后指标对比结果见表4。

表4　入池前后指标分析

2.2.2正交实验结果

正交实验是常用的优化工艺条件的方法，为了对丢糟产酒工艺条件进行优化，设计了3因素3水平的正交实验（见表5）。本实验中选取功能性纤维素酶帘子曲用量、TH-AADY活化液用量以及糖化酶液用量为考察因素，根据文献资料和单因素实验确定各因素的水平数和各水平的取值，以出酒率为指标，采用正交表L9（33）进行正交实验，实验结果见表6。

表5　因素水平表

表6　正交实验结果

从表6可以看出，利用丢糟进行二次发酵产酒时各组分的最佳添加量为：功能性纤维素酶帘子曲用量为1.5 kg/100 kg丢糟，糖化酶用量为250 U/g淀粉，THAADY添加量为1.5‰，此时出酒率为3.89%。

丢糟中残余淀粉含量为11.3%，进行入池二次发酵结束后残留淀粉降为5.8%，淀粉含量降低了5.5%，淀粉再利用率达到48.7%，丢糟出酒率为3.89%（按60%vol计），进一步证明了利用功能性纤维素酶帘子曲、糖化酶以及TH-AADY进行丢糟再发酵产酒具有可行性，并能产生较为可观的经济效益。

2.2.3糟酒主要理化指标

糟酒理化指标及感官品评结果见表7和表8。

表7　糟酒理化指标

表8　糟酒感官品评结果

3　结果与讨论

3.1霉菌需要纤维素类物质或其衍生物作为诱导物才能分泌纤维素酶，但由于纤维素不溶于水，本课题采用纤维素的衍生物CMC（羧甲基纤维素钠）作为唯一碳源来筛选高产纤维素酶的霉菌。

3.2在筛选过程中发现个别菌株在刚果红培养基平板上水解圈较大，但经发酵产酶复筛后，其CMC酶活和FPA酶活并不高，其原因可能是筛选所用的固体培养基和发酵所用的液体培养基培养条件不同；另外，筛选培养基的厚度和菌落菌体量的差异也会影响水解圈的大小；还有菌体在平板上和液体培养基中吸收营养物质、排出代谢产物难易程度不同；以及不同菌株具有不同的生长和产酶速度以及不同的纤维素酶系；另外有些菌株水解圈较大，可能是因为它的CMC酶活较高，尤其在羧甲基纤维素钠初筛培养基平板上这种现象更为明显一些。总之，通过观察平板上水解圈的初筛方法可以将一大批产酶能力差的菌株筛选出去，大大提高了筛选效率。

3.3经过2次EMS连续诱变后，得到了1株纤维素酶活较高的诱变菌株RY49，其纤维素酶活达到了滤纸酶活91.32 U/mL，CMC酶活273.56 U/mL，比出发菌株分别提高了68.1%和53.6%。经传代培养实验，证明该菌株产酶稳定性良好。

3.4考虑到使用过程中的方便性以及确保酶活不易失活等因素，本研究中选育的高产纤维素酶菌株并未直接应用，而是进一步制备成功能性纤维素酶帘子曲加以应用，但所制的帘子曲属于粗产品，由于技术条件有限，未进行进一步纯化，因此酶活相对较低，如果进行纯化后，可能会进一步提高酒糟产酒率，但综合考虑提纯成本与糟酒的效益，进行提纯后可能得不偿失。

3.5本实验仅对丢糟再发酵产酒进行了初步研究，最佳添加量：功能性纤维素酶帘子曲用量为1.5 kg/100 kg丢糟，糖化酶用量为250 U/g淀粉，TH-AADY添加量为1.5‰，此时出酒率为3.89%。如果还需进一步研究，可对发酵时间、入窖酸度等因素进行深入的研究。

3.6在丢糟发酵产酒中还可加入一定量大曲粉，或加入不同种类的功能性细菌帘子曲、功能性酵母帘子曲，除有效提高丢糟出酒率外，还能提升糟酒的感官质量。

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Breeding of a Strain with High Yield of Cellulase from Daqu and Its Application in Waste Distillers Grains of Soft-Flavor Baijiu

YANG Jianmei，WANG Xiaohui，WANG Yongwei and LUO Xia
（Yanghe Distillery Co.Ltd.，Suqian，Jiangsu 223800，China）

A strain with strong cellulase-producing capability was screened from Daqu.After continuous mutagenesis，a mutant strain RY49 with high yield of cellulase was obtained.Strain RY49 was then used for the preparation of functional bran starter.Such starter，coupled with saccharifying enzyme and TH-AADY，were used for secondary fermentation of waste distillers grains of soft-flavor Baijiu，and liquor yield could reach up to 3.89%（60%vol liquor/100 kg waste distillers grains）.As a result，the additional benefits of waste distillers grains got improved efficiently.

high yield of cellulase；strains；mutation；waste distillers grains；functional bran starter；saccharifying enzyme；TH-AADY；Baijiu

TS261.1；Q93-3；TS262.3；TS261.4

A

1001-9286（2016）08-0071-05

10.13746/j.njkj.2016168

2016-05-17

杨建梅（1987-），女，山东烟台人，硕士研究生，主要从事微生物的检测及应用相关研究。

优先数字出版时间：2016-05-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160526.1216.012.html。