清、浓、酱三种大曲真菌多样性初步分析

胡佳音，周　森，赵卫鹏，于晓涛，刘红霞，张如金

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

清、浓、酱三种大曲真菌多样性初步分析

胡佳音，周森，赵卫鹏，于晓涛，刘红霞，张如金

（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京101301）

采用传统分离方法结合高通量测序对清香、酱香、浓香3种大曲真菌进行多样性分析，两种方法所获得结果较为一致。研究表明，清香型大曲真菌主体较为明显，扣囊复膜酵母S.fibuligera和伞枝横梗霉L.corymbifera是绝对主体，占94%，而生香酵母和酿酒酵母数量较少。浓香型大曲和酱香型大曲多样性结果较为接近，两种大曲中较难分离到酵母类真菌，其主体菌均为谢瓦散囊菌E.chevalieri。区别在于，浓香型大曲中真菌种类较多，数量较为接近，而酱香型大曲中，真菌多为耐热丝状真菌和青霉菌。

微生物； 真菌； 扣囊覆膜酵母； 谢瓦散囊菌； 高通量测序

中国白酒作为世界六大蒸馏酒之一，具有悠久的历史和深厚的酒文化内涵，深受消费者喜爱。大曲是白酒中主要糖化发酵剂，在酿造过程中起着糖化、生香、发酵、提供菌源的作用，具有“酒之骨”的美称，可见大曲在发酵中的重要地位。大曲中真菌类微生物可分为丝状真菌和酵母菌两大类。其中，丝状真菌往往具有较高的糖化力，例如米根霉、黑曲霉。而生香、发酵往往依靠生香酵母和酿酒酵母等酵母类真菌。可以看出，大曲中的真菌同大曲在酿造中的作用息息相关。同时，在大曲制作过程中真菌生长不仅代谢产物，更为发酵初期糖化提供各种酶类物质。

清香、浓香、酱香是我国传统的三大香型白酒，现今许多种香型均从其演变而来。对这3种大曲真菌多样性进行研究，了解不同微生物之间的比例，使我们认识到不同香型大曲真菌之间的差异。

1　材料与方法

1.1实验样品

中低温清香型大曲、中高温浓香型大曲、高温酱香型大曲。

1.2主要仪器

北京东联哈尔仪器制造有限公司BSC-1100ⅡA2型生物安全柜；美国BIORAD公司梯度C1000快速梯度基因扩增仪；美国BIORAD公司基础型水平电泳仪；美国BIORAD公司全自动凝胶成像仪；德国Eppendorf公司1-14k高速冷冻离心机；宁波江南SPX-320型生化培养箱。

1.3培养基

酵母分离培养基（YPD培养基）：yeast extract 10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 L。

丝状真菌分离培养基（PDA培养基）：马铃薯浸提液500 mL，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水500 mL。

孟加拉红培养基：北京澳博星生物技术有限责任公司。

察氏培养基：北京澳博星生物技术有限责任公司。

1.4大曲微生物分离鉴定

将3种不同大曲分别粉碎混合，称取10 g和1 g备用，取10 g大曲样品于90 mL无菌水中振荡混匀，拟定为10-1浓度。吸取1 mL到9 mL无菌水中为10-2，依次稀释为10-3、10-4、10-5浓度，分别吸取10-3、10-4、10-5稀释液0.1 mL，每个梯度分别涂布于相应培养基平板上。将涂布好的平皿依常规培养法培养，培养的微生物包括丝状真菌、酵母菌。培养温度分别为丝状真菌30℃、酵母28℃，培养时间根据菌落的生长情况而定，一般为24～48 h。根据选择培养的结果，酵母菌以10-4板，丝状真菌以10-3板为主计数，乘以稀释倍数计算不同微生物的种群数量。其余梯度每个平板挑取不同形态的单菌落，接种在斜面上，28℃培养2 d，挑取新鲜的纯菌接种至20%甘油管，于-80℃超低温冰箱中保藏。

1.5真菌分子鉴定

酵母DNA采用酵母基因组DNA提取试剂盒（天根生化）提取，丝状真菌先用液态氮处理后，采用土壤基因组DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）提取。PCR反应条件：94℃加热3 min使模板DNA变性，然后进入下列温度循环：94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，共进行35个循环，最后在72℃延伸5 min。酵母类引物NL1（5'-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG）。丝状真菌采用ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC）。

PCR产物送公司测序后，用Chromas软件分析测序质量，去除峰图不可靠的部分对DNA序列进行手动校正，用校正后的序列在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast）中进行同源序列搜索。

1.63种大曲高通量测序

称取1 g混匀大曲样品，用Fastprep处理后，采用土壤基因组DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）提取。浓度检测合格后，送北京奥维森公司对真菌Its区Its1-Its2进行高通量测序，原始序列数据通过公司进行质量控制，舍弃低质量序列。之后用QIIME软件进行总体分析，利用软件将序列相似性大于97%的定位为1个OTU（operational taxonomic units）。选取分析数据中每个OTU中具有代表性的序列，通过blast比对，获得每一个OTU种名。

2　结果与分析

2.13种大曲真菌分离数据

通过表1可以看出，清香型大曲中的主要真菌为扣囊复膜酵母和丝状真菌，而酿酒和生香类酵母数量较少。浓香型大曲中，主要真菌是丝状真菌且含有少量扣囊复膜酵母。酱香型大曲中，所分离到真菌均为丝状真菌，未分离到其余真菌。

表1　3种大曲真菌分离结果　（cfu/g）

通过表2可以看出，同酱香型和浓香型大曲相比，清香型大曲中酵母类真菌种类较多，分别为异常汉逊酵母、扣囊复膜酵母、酿酒酵母、东方伊萨酵母、弗比恩毕赤酵母5种。丝状真菌为产黄青霉、分枝横梗霉和伞枝横梗霉3种。浓香型大曲和酱香型大曲中未分离到酵母类真菌，均为丝状真菌。浓香型大曲中分离到4种丝状真菌，分别为：黄曲霉A.flavus、嗜热子囊菌T.lanuginosus、微小根毛霉R.pusillus和谢瓦散囊菌E.chevalieri。酱香型大曲共分离到7种丝状真菌，分别为：嗜热子囊菌T.lanuginosus、曲霉A.hiratsukae、丝衣霉B.spectabilis、产黄青霉P.chrysogenum、曲霉A.ochraceus、伞枝横梗霉L.corymbifera、谢瓦散囊菌E.chevalieri。

表2　3种大曲真菌分离结果

由于丝状真菌具有孢子和密集菌丝，仅仅依靠传统方法分离较难准确获得大曲中真菌种类规律，所以，丝状真菌种类统计需要结合高通量数据进行确定。

图1　清香型大曲高通量数据

2.23种大曲高通量测序结果分析

本次高通量测序中清香型大曲中共获得79种OUT，挑选数量较多的前20种OUT Blast比对后进行分析。由图1可以看出，在清香型大曲中，扣囊复膜酵母S.fibuligera是绝对主体，占73%，伞枝横梗霉L.corymbifera占21%，热带假丝酵母C.tropicalis占2.2%，P.sorbitophila 占1.2%，毕赤酵母P.kudriavzevii占0.5%，酿酒酵母S. cerevisiae占0.5%，其余真菌占1.6%。可以看出，扣囊复膜酵母和伞枝横梗霉在清香型大曲中占94%，是构成清香型大曲真菌的主要微生物，生香类酵母和产酒类酵母在大曲中数量较少。

本次高通量测序中浓香型大曲中共获得142种OUT，挑选数量较多的前20种OUT Blast比对后进行分析。通过图2可以看出，浓香型大曲微生物多样性较为丰富，主要真菌为谢瓦散囊菌E.chevalieri，占52%，米曲霉A.oryzae占11.7%，毕赤酵母P.kudriavzevii占8.9%，嗜热子囊菌T.lanugin占6.2%，假丝酵母C.catenulata占3.2%，异常维克汉米酵母W.anomalus占2.4%，扣囊复膜酵母S.fibuligera占1.9%。可以看出，浓香型大曲中，主体真菌微生物是谢瓦散囊菌，占52%，其余像米曲霉、毕赤酵母、嗜热子囊菌等真菌在大曲中所占比例为34.3%。余下的真菌虽然所占比例较少，但种类较多，共占13.7%。

图2　浓香型大曲高通量数据

图3　酱香型大曲高通量测序

本次高通量测序中酱香型大曲中共获得139种OUT，挑选数量较多的前20种OUT Blast比对后进行分析。由图3可以看出，酱香型大曲中主要真菌为谢瓦散囊菌E.chevalieri（占43%）和嗜热子囊菌T.lanuginosus（占34.8%）这两类。其他如多变拟青霉P.variotii占6.5%，青霉属Penicillium sp.占5.9%，热子囊菌T.crustaceus占4.9%，余下真菌共占4.9%。可以看出，酱香型大曲中酵母类真菌数量较少，主要为高温高渗丝状真菌。整个大曲中，谢瓦散囊菌和嗜热子囊菌共占77.8%，为主体微生物。其余数量较多的真菌属于青霉属和耐热子囊菌类。

3　讨论

对3种大曲进行真菌多样性分析，可以看出，两种方法所获得结果较为一致。

清香型大曲属于中低温培养大曲，较适应真菌类生长，因此真菌种类较多。其中最主要的真菌是扣囊复膜酵母和伞枝横梗霉，而被认为在发酵中起主要作用的酿酒酵母和生香酵母所占比例较少，在大曲中只是充当种子作用。

浓香型大曲属于中高温大曲，制曲温度一般在50～60℃。传统分离方法只在浓香型大曲中分离到丝状真菌和扣囊复膜酵母。但在高通量分析中，浓香型大曲中微生物种类较多，其主体为谢瓦散囊菌，同时也检测到了毕赤酵母、假丝酵母、异常维克汉姆酵母等生香类酵母，而这些生香类酵母菌在传统分离方法中并未分离到。推断认为，由于浓香型大曲制曲过程中温度过高，造成多数酵母类微生物死亡，而其DNA在制曲过程中并未降解，所以在高通量中被检测出而无法分离到活体菌株。

酱香型大曲属于高温大曲，制曲温度一般在60～70℃，造成了其主体真菌属于耐高温一类的谢瓦散囊菌、嗜热子囊菌、多变拟青霉、热子囊菌等，而酵母类真菌和不耐高温类丝状真菌等无法在酱香型大曲中存活。

制曲过程是环境中微生物的富集过程，同时也是一个选择优化的过程，为不同香型发酵菌系的形成提供了重要保障。清香型白酒属于清蒸清茬发酵工艺，其制曲工艺采用中低温制曲，这种较为温和的制曲方式可以保证其中酿酒酵母、生香酵母及丝状真菌的存活，从而提供其发酵中所需要的多种真菌。相对于清香型白酒，浓香型白酒在发酵中窖泥和母糟内含有大量发酵所需酵母菌和丝状真菌，酱香型白酒入池前需要进行堆积富集微生物，这两种香型在发酵前均可以从发酵环境中获得众多真菌。所以，浓香、酱香两种大曲中主体真菌均为耐热真菌，较难分离到酵母类真菌。

对以上3种大曲微生物多样性进行系统分析，使我们认识到3种大曲微生物之间的差异，既可以对不同香型强化大曲提供理论指导，也可以对不同大曲混合发酵生产特色香型等工艺的改进提供理论支撑。

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Preliminary Analysis of Fungal Diversity in Qingxiang Daqu，Nongxiang Daqu and Jiangxiang Daqu

HU Jiayin，ZHOU Sen，ZHAO Weipeng，YU Xiaotao，LIU Hongxia and ZHANG Rujin
（Niulanshan Distillery，ShunxinAgriculture Co.Ltd.，Beijing 101301，China）

Fungal diversity in Qingxiang Daqu，Jiangxiang Daqu and Nongxiang Daqu was analyzed by using traditional separation methods/ high throughput sequencing.Both methods obtained almost identical results.The main fungi of Qingxiang Daqu was evident，S.fibuligera and L.corymbifera accounted for 94%，and the amount of aroma-producing yeasts and S.cerevisiae was less.The fungal diversity of Nongxiang Daqu and Jiangxiang Daqu were more similar.Yeast-like fungi were hardly isolated in both Daqu and their main fungus was E.chevalieri.The difference was that，there were more fungal varieties in Nongxiang Daqu and their amounts were close，however，fungi in Jiangxiang Daqu were mainly heat-resistance filamentous fungi and Penicillium.（Trans.by YUE Yang）

microbe；fungus；Saccharomycopsis fibuligera；Eurotium chevalieri；high throughput sequencing

TS261.1；Q93-3；TS262.3

A

1001-9286（2016）08-0087-04

10.13746/j.njkj.2016121

2016-04-11

周森（1986-），男，工程师，大学本科，研究方向为白酒酿造微生物研究。

张如金。

优先数字出版时间：2016-06-16；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160616.1431.004.html。