贵州地方鸡种主要疫病流行情况监测

韩 雪，徐 丹，徐景峨，苗小猛，伍革民，冯宇隆，伍友豪，舒 刚，赵小玲

（1.贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005；2.贵州宏宇畜牧技术发展有限公司，贵州贵阳 550005；3.四川农业大学，四川成都 611130）

2021 年新一轮全国畜禽遗传改良计划针对地方特色品种鸡生产性能低、生物安全体系不健全、疫病净化不到位等问题提出了一系列的要求及目标，强调了加强对地方鸡种种源垂直传播疫病的净化，重点净化以鸡白痢沙门氏菌病、禽白血病等为主的种源垂直传播疫病。在当前国家政策的要求下，应加强家禽疫病综合防控工作，着力解决我国家禽养殖业疫病防控的短板[1]。

贵州地处中国西南部，地势复杂，具有高原、山地、丘陵和盆地等4 种地形，其中92.5%的面积为山地和丘陵。其多样的地形地貌和丰富的林地资源，以及多民族的人文背景，造就了极为丰富的家禽资源，拥有毕节地区乌蒙乌骨鸡和威宁鸡、安顺地区高脚鸡、黔西南地区兴义矮脚鸡、黔东南地区小香鸡、遵义地区赤水乌骨鸡、长顺绿壳蛋鸡、黔南地区瑶山鸡等8 个国家畜禽遗传资源品种。这些品种具有丰富多样的体型外貌特征、优良的肌肉品质和突出的抗病和抗逆能力，是保障人民群众日益丰富的物质文化需求的重要基因库[2]。近年来，随着贵州生态家禽产业不断发展壮大，优质地方鸡的开发利用也越来越受重视。但是，随着养殖规模的壮大、集约化水平低、养殖环境差等因素造成各种疫病频发，严重危害了贵州地方养禽业的发展[3]。

为了保障贵州地方优质鸡种产业的大力发展，减少疫病对养殖业的冲击，本文首次系统的对贵州8 个地方鸡种的各类主要疫病流行情况进行了调查，以期为贵州地方鸡养殖中鸡白痢、大肠杆菌病、禽流感、新城疫、禽白血病等常见疫病的防控及净化工作提供流行病学依据，为贵州地方鸡种常见疫病预防提供数据支撑，促进健康养殖，提高经济效益。

1 材料与方法

1.1 试验样本采集

2021 年，本研究从贵州乌蒙乌骨鸡、威宁鸡、普定高脚鸡、兴义矮脚鸡、黔东南小香鸡、赤水乌骨鸡、长顺绿壳蛋鸡和瑶山鸡等8 个地方鸡种鸡场（户）采集了用于禽流感和新城疫抗体滴度测定的240 份鸡翅静脉血清样品，用于禽白血病-J 亚群的酶联免疫吸附试验检测的240 份泄殖腔棉拭子，以及用于沙门氏菌和大肠杆菌分离的240 份泄殖腔棉拭子。各个群体随机抽取30只鸡（公母各半）进行大体解剖，临床鉴别判断禽流感、新城疫及肿瘤病变。收集肿瘤样本进行组织病理学诊断，解剖过程中仅在乌蒙乌骨鸡中发现一例肿瘤病变。样本信息见表1。

1.2 主要试剂及仪器

禽白血病-J 亚群抗体检测试剂盒购自美国IDEXX 公司；1%公鸡红细胞悬液（自配），禽流感抗原和阳性血清由哈尔滨国生生物科技股份有限公司提供，新城疫抗原和阳性血清由中国兽医药品监察所提供。LB 肉汤、SC 肉汤培养基、MH 肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、SS 琼脂培养基、亚硫酸铋培养基等均购于杭州天和微生物试剂有限公司。8 种药敏纸片（多西环素、妥布霉素、阿奇霉素、氨苄西林、红霉素、庆大霉素、诺氟沙星、新霉素）购自成都市科龙化工试剂厂。

立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50FBS，上海申安医疗器械厂），微量加样器（德国Eppendorf公司），超净工作台（江苏苏静集团泰安有限公司），恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司），数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），气浴恒温振荡器（金坛市科析仪器有限公司），电热鼓风干燥箱（101-4，上海实验仪器厂有限公司），电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司），旋涡混合器（XW-80A，上海青浦沪西仪器厂），徕卡显微成像系统（DM1000，德国Leica），石蜡切片机（RM2235，德国Leica）。

1.3 试验方法

1.3.1 禽白血病及新城疫、禽流感抗体水平测定

按照禽白血病-J 亚群的ELISA 抗体检测试剂盒说明书进行抗体检测和结果判定。新城疫抗体检测参照《新城疫诊断技术》（GB/T16550—2020），采用血凝（HA）血凝抑制试验（HI）方法进行，HI 抗体≥4log2 的样品判定为合格。禽流感H5 亚型H5（Re-6）、H5（Re-8）、H9 亚型禽流感抗体检测参照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936—2020），采用血凝（HA）和血凝抑制试验（HI）方法进行，HI 抗体≥5log2的样品判定为合格[4]。

1.3.2 大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定及耐药性检测

（1）细菌分离纯化

无菌采集泄殖腔棉拭子样本，划线接种于麦康凯琼脂培养基，37℃恒温培养12～24h，在麦康凯培养基上生长出表面光滑湿润、边缘整齐稍凸起，直径1～2mm 的红色圆形菌落，接种到SS培养基37℃培养12～24h，生长出粉红菌落，在亚硫酸铋琼脂表现不生长，革兰氏染色阴性小杆菌，则判定为大肠杆菌；在麦康凯培养基上生长出淡黄色半透明单个菌落，接种到SS 培养基37℃培养12～24h，生长出无色至灰白色，半透明或不透明，菌落中心有时呈黑色的菌落，在亚硫酸铋琼脂生长为绿色单个菌落，革兰氏染色阴性小杆菌，则判定为沙门氏菌。重复上述纯化步骤2 次[5]。

（2）药敏试验

采用平板计数法将菌液浓度调至1.0×106CFU/mL，将调制后菌液200μL 均匀涂抹于普通琼脂培养基，取8 种抗生素药敏纸片（庆大霉素、妥布霉素、新霉素、阿奇霉素、多西环素、红霉素、诺氟沙星、氨苄西林），平整贴在培养基上，37℃培养24h 后，测定细菌抑菌圈大小。药敏试验采用Kirby-bauer 琼脂扩散法[6]，依照药敏纸片的抑菌效果范围标准判定药物敏感程度（表2）。

表2 药物敏感性标准

1.3.3 肿瘤组织病理学诊断

将4%多聚甲醛固定的组织样本，经流水冲洗30min，进行组织修块，放入病理包埋塑料筐中进行脱水（75%乙醇6h，85%乙醇10h，95%乙醇4h，无水乙醇Ⅰ2h，无水乙醇Ⅱ2h），透明（二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ15min），浸蜡3h，包埋组织块于石蜡中。随后采用Leica RM2235切片机将组织切成5μm 厚的薄片，在温水中将组织展平后捞在载玻片上，60℃烘烤切片至少2h。之后，切片经二甲苯脱蜡后，流水洗涤20min，用苏木素染色30min，流水洗涤20min，盐酸酒精分化，伊红染色5min，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明后用树脂胶封片。在显微镜下观察肿瘤的病理变化，完整地浏览整张组织片，对各组明显病变的部位均采用显微成像系统拍照记录。

1.4 数据分析

将检测结果录入Excel，按区域和场点类别对检测结果进行统计和描述，分析得出不同地区、不同品种鸡群疫病流行情况。

2 结果

2.1 血清抗体检测结果

8 个贵州地方品种鸡群的血清禽白血病抗体检测结果如表3 所示，禽白血病平均抗体阳性率为38.75%。不同品种鸡群中禽白血病抗体的阳性率存在一定差异：兴义矮脚鸡最低（10%），赤水乌骨鸡最高（76.66%）；威宁鸡、乌蒙乌骨鸡和赤水乌骨鸡三个品种鸡群禽白血病阳性率超过50%。贵州黔南自治区、贵州黔东南自治区、贵州省毕节市、贵州黔西南自治区和贵州省遵义市5 个区域的禽白血病阳性率结果对比显示，贵州黔西南自治区最低（10%），贵州省遵义市最高（76.66%），贵州省毕节市禽白血病阳性率也超过50%。此外，从样本来源角度分析，保种场来源的鸡群禽白血病阳性率为46.11%，而保护区农户来源的鸡群禽白血病阳性率为16.67%。

表3 贵州省各地方品种鸡鸡群禽白血病抗体检测结果

8 个贵州地方品种鸡群的血清新城疫和禽流感抗体检测结果如表4 所示，所有品种新城疫抗体效价均高于4log2，符合免疫要求。威宁鸡和赤水乌骨鸡禽流感病毒H9 亚型抗体效价低于5，需要补充疫苗接种；兴义矮脚鸡和普定高脚鸡禽流感病毒H5N8 亚型抗体效价为0，可能没有注射该血清型疫苗，需要补充疫苗接种；兴义矮脚鸡、黔东南小香鸡和普定高脚鸡禽流感病毒H5N6 亚型抗体效价低于5，需要补充疫苗接种。此外，临床解剖诊断未发现禽流感和新城疫感染病例，所有泄殖腔棉拭子样本均未检出禽流感病毒和新城疫病毒特异性核酸，8 个地方品种鸡群无禽流感和新城疫感染。

表4 贵州省各地方品种鸡鸡群新城疫和禽流感抗体检测结果 单位：nlog2 个滴度

2.2 大肠杆菌和沙门氏菌的分离及耐药性检测结果

细菌分离结果如表5 所示，从长顺绿壳蛋鸡、兴义矮脚鸡、黔东南小香鸡、普定高脚鸡、赤水乌骨鸡和瑶山鸡泄殖腔棉拭子中分离出大肠杆菌菌株；从普定高脚鸡和赤水乌骨鸡泄殖腔棉拭子中分离出沙门氏菌菌株。威宁鸡与乌蒙乌骨鸡未分离出大肠杆菌及沙门氏菌菌株。

表5 贵州各地方品种鸡肛门拭子细菌分离情况

所分离出的大肠杆菌和沙门氏菌药敏结果如表6 所示，结果显示来自贵州省6 个地方品种鸡泄殖腔棉拭子所分离的大肠杆菌和沙门氏菌均存在不同程度的耐药问题。其中从长顺绿壳蛋鸡分离出的大肠杆菌菌株对庆大霉素、多西环素、诺氟沙星和阿奇霉素敏感，对妥布霉素、红霉素和氨苄西林耐药；从黔东南小香鸡分离出的大肠杆菌菌株对庆大霉素、多西环素、红霉素、和诺氟沙星敏感，对妥布霉素和氨苄西林耐药。从兴义矮脚鸡分离出的大肠杆菌菌株对庆大霉素和妥布霉素敏感，对红霉素、多西霉素和氨苄西林耐药；从普定高脚鸡分离出的大肠杆菌菌株对庆大霉素、妥布霉素和新霉素敏感，对多西霉素、红霉素、阿奇霉素和氨苄西林耐药；从瑶山鸡分离出的大肠杆菌菌株仅对庆大霉素敏感，对多西环素、妥布霉素、红霉素、阿奇霉素和氨苄西林耐药；从赤水乌骨鸡分离出的大肠杆菌菌株仅对诺氟沙星敏感，对庆大霉素、多西环素、妥布霉素、新霉素、红霉素和氨苄西林耐药。对于所分离出的沙门氏菌菌株，从赤水乌骨鸡中分离的菌株对多西环素、妥布霉素、阿奇霉素和氨苄西林耐药，对庆大霉素敏感；从普定高脚鸡所分离出的菌株仅对红霉素和氨苄西林耐药，对庆大霉素、多西环素、妥布霉素、新霉素和诺氟沙星敏感。

表6 抑菌圈直径 单位：mm

2.3 肿瘤病理检测结果

在乌蒙乌骨鸡中这例肿瘤样本病理诊断结果为肝脏组织胆管癌。组织病理学显示肝内胆管系统上皮恶性细胞增生。瘤细胞呈立方形，泡状核，胞质中的嗜碱性颗粒较少，排列以管状结构为主。大量增生的胆管上皮细胞为立方柱状上皮细胞，呈腺体样复合排列，有或无管腔，通过组织细胞隔彼此分离，与肿瘤增殖相关的异嗜性粒细胞浸润明显（图1）。

图1 乌蒙乌骨鸡鸡肝脏胆管瘤病理切片图

3 讨论

从监测结果来看，贵州地方品种鸡有不同程度禽白血病感染情况，应加强对禽白血病的防控，特别是贵州省毕节市毕节地区威宁鸡和乌蒙乌骨鸡以及贵州省遵义市赤水乌骨鸡存在严重感染。该病尚无疫苗和特效药，有效的防控方法是以“检测-淘汰阳性鸡”为主的净化措施。张小波等人在2019 年对贵州地方品种鸡禽白血病流行病学调查的研究中同样提示毕节地区威宁鸡和乌蒙乌骨鸡存在禽白血病严重感染的现象[7]。此外，本试验采用泄殖腔棉拭子ELISA 检测，而鸡基因组中内源性的禽白血病-E 亚群cDNA 在一定条件下会表达出完整的禽白血病，因此可能出现禽白血病阳性率检测偏高的现象[8]。禽白血病多以隐性感染形式存在于临床健康鸡群中，当鸡群因各种应激因素导致抵抗力降低时，这些病毒就会大量复制，从而引起鸡群发病和死亡，并可垂直传播给下一代，导致上述病原难以根除。外来品种带入、自然感染和部分禽用疫苗制品质量不达标，可能是导致这些病原在鸡群中广泛存在的重要原因[9]。因此，贵州地方品种鸡群对禽白血病的防控不仅应该注意鸡群之间的传播，也应该对地区之间禽类交易及运输做好相关的措施。此外，本试验在8 个贵州地方鸡群中均未检出禽流感和新城疫感染病例，提示鸡场对这两种疾病的防控工作效果较好。新城疫抗体水平较为理想，基础免疫程序合理，疫苗免疫效果良好，为鸡群提供了较好的保护力。禽流感是一种严重危害家禽产业发展的烈性传染病[10]，贵州8 个地方鸡种禽流感抗体水平不整齐，特别是农户散养土鸡兴义矮脚鸡和普定高脚鸡，这两个鸡群禽流感各血清型的抗体效价不够高或者离散度大，抗体滴度差距大，建议定期开展免疫抗体监测，同时增加免疫程序管理，提高鸡群免疫抗体保护力。

沙门氏菌和大肠杆菌均是条件性致病菌，当动物机体抵抗力下降时，细菌与宿主的生态平衡被打破，细菌的致病性便会表现出来，严重危害机体健康[11,12]。大肠杆菌与沙门氏菌既可单独感染鸡群，也可与其他病原菌混合感染致发病，实际生产中大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的病例尤为突出，在我国养鸡行业广泛存在，其危害贯穿整个养殖周期，导致经济效益下降等一系列问题[5]。因此，对沙门氏菌的流行和感染状态进行监测具有十分重要的意义。本试验检测结果提示威宁鸡与乌蒙乌骨鸡日常卫生管理水平良好，清栏、消毒等措施较佳，未检出大肠杆菌和沙门氏菌；其他6 个贵州地方品种泄殖腔棉拭子中均分离出大肠杆菌菌株，且普定高脚鸡和赤水乌骨鸡的泄殖腔棉拭子中分离出沙门氏菌菌株，提示有沙门氏菌和大肠杆菌感染的风险。因此，建议相关养殖场（户）加强日常管理，提高生物安全意识，严格落实各项消毒制度，从而降低大肠杆菌病和鸡白痢的发生及危害。

大肠杆菌和沙门氏菌都易产生对抗生素的耐受性，而且多重耐药现象严重，尤其是大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的病例[13]。混合感染时，鸡的死亡率较高，用药难度较大，其发病率、死亡率显著增高。两种细菌血清型种类较多，不同地区差别较大，不同菌株之间不产生交叉保护作用，极易产生耐药性[14]。本试验结果表明，来自贵州省6 个地方品种鸡泄殖腔棉拭子所分离的大肠杆菌和沙门氏菌均存在不同程度的耐药问题，提示这些鸡场可能存在抗生素滥用的情况，因此建议这些鸡场若发生此类型病情时应根据药敏试验结果指导科学用药，且应注意交替用药，或选用中药抗菌制剂，以获得良好的治疗效果。根据大肠杆菌与沙门氏菌的流行特点，要有效控制和预防疾病的发生，首先应该加鸡场强饲养管理水平，改善环境卫生条件，同时提高鸡群免疫力和鸡场生物安全管理能力，从而有效抵御病原的侵袭，减少重大疫病发生风险。

本次试验发现，8 个贵州地方品种鸡群随机大体剖检结果，仅仅发现一列肿瘤病变，彰显了贵州地方鸡种独特的环境适应性、抗寒、抗潮湿、抗病性[2]。与本试验监测结果一致，前人研究发现贵州地方鸡常见疾病为病毒或细菌引起的传染病[15]。回溯贵州8 个地方种鸡群采样场群发现，不同养殖环境、不同种鸡品种及其来源地区等与病毒或细菌性疾病的发生情况密切相关。因此，在开展贵州地方品种鸡保种选育及开发利用过程中，针对不同地区和不同品种，加强持续不断地监测，及时淘汰患病阳性鸡；改善饲养条件，重视鸡舍建筑；加强饲养管理和消毒杀菌技术，制定合理的免疫防控措施；逐步实现对贵州地方鸡群传染性疾病的净化。

4 结论

8 个贵州省地方鸡种白血病阳性率为10%～76.66%；新城疫抗体水平较为理想，但禽流感抗体水平不整齐，未检出禽流感和新城疫感染病例；除威宁鸡和乌蒙乌骨鸡外，其他6 个贵州地方品种泄殖腔棉拭子中均分离出大肠杆菌菌株，普定高脚鸡和赤水乌骨鸡的泄殖腔棉拭子中分离出沙门氏菌菌株，且均存在不同程度的耐药。通过掌握贵州地方鸡的常见疾病，做好相对应的防治措施，可有效提升贵州地方鸡的生产性能和养殖效益，有利于开展和推进贵州地方鸡的品种保护工作，提升贵州地方鸡的价值。