鸡滑液囊支原体病防治研究进展

张永康，郭亚男，徐婧祎

（1.宁夏职业技术学院生命科技学院，宁夏银川 750021；2.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002）

支原体也被称作霉形体（Mycoplasma），是如今能在培养基中生长繁殖的最小微生物[1,2]。研究发现，支原体不仅在自然界中广泛分布，而且病原体也可以从人和动物中分离出来，并且易污染细胞和病毒，这将对细胞繁殖和病毒生产试验产生严重影响[3,4]，给生物制药公司的生产和实验室研究带来很多麻烦。禽支原体病是兽医临床上的一种常见的高危传染病，鸡群一旦感染就无法根除。鸡滑液囊支原体是禽支原体中的一种，菌体通常表现为球形或卵圆形，直径大小约0.2μm，是无细胞壁的原核单细胞微生物。在39℃以上的环境下难以生存，合适的低温下可被保存数年[5]。

鸡滑液囊支原体（Mycoplasma Synoviae，MS）是[6,7]一个独立的分支，和其他支原体不同。感染MS 能够导致鸡系统性感染且引发传染性滑膜炎，临床表现为鸡明显跛行、采食量下降以及生长迟缓等[8]。MS 多为隐性感染，不易被察觉，多数情况下呈现亚临床型，当有传染性支气管炎、新城疫等疾病并发感染时，能够造成气囊病变，感染程度却明显小于鸡毒支原体[9,10]。

1 病原学

1.1 鸡滑液囊支原体的形态结构

鸡滑液囊支原体的大小介于细菌和病毒之间，是一类无细胞壁的原核细胞型微生物[11]，它的形态多样[12]，质地柔软，可以使用0.45μm 的细菌滤器进行过滤，繁殖方式为芽生和二分裂[13]。在改良Frey 氏固体培养基上以5%CO2、37℃的条件培养MS 3～5d，然后，在100 倍显微镜下，菌落显示出典型的“卵形或煎蛋样”[13,14]。MS 的菌落很小，肉眼只能观察到针尖大小且难以察觉，如果长时间培养，菌落周边还可能形成膜斑。对禽类滑膜的超微结构的研究表明，在电子显微镜下可以观察到MS 菌体细胞具有多种形态，大部分显示为圆形或梨形[14,15]，在内吞小泡中存在，有核糖体但无细胞壁，外包三层膜，直径在300～500nm[16]。

1.2 鸡滑液囊支原体的培养与染色

鸡滑液囊支原体在生长繁殖时没有合成自身所需物质的能力且代谢能力有限，因此需要从外界吸收自身所需的营养物质[17]。培养MS 除了要在培养基中添加基础营养物质，加入血清和酵母浸出液以及精氨酸等物质也是必不可少的[17]。高密度脂蛋白是血清中所含胆固醇的主要成分，主要供给其所需的胆固醇和脂肪酸，另外血清中存在的清蛋白也是MS 生长所需脂肪酸的载体[18,19]。MS 培养基中必不可少的成分也包括酵母浸出液，特别是MS 缺乏乳清酸代谢途径不能合成嘧啶且缺少酶促代谢途径不能合成嘌呤[17]，而酵母浸出液中存在有大量的核酸和核酸前体，可以进行补救合成相应的核苷酸，此外维生素和氨基酸以及生长因子的存在，对于促进MS 的生长繁殖和提高其在培养基中的生长率起到了至关重要的作用[20]。MS 在生长繁殖过程中所需的0.01%烟酰胺嘌呤二核苷酸价格高昂[21]，并且不可同培养基中的成分一同高压灭菌，必须单独过滤除菌。马血清和猪血清是改良Frey 氏培养基中经常加入的物质，但是猪血清的稳定性差，无法确保其不被支原体污染，因此马血清成了较好的选择[22]。目前实验室主要使用的MS 培养基有MS 肉汤基础培养基和改良Frey 氏培养基，但培养基中通常都含有血清和酵母浸出液以及精氨酸等营养物质，另外还会添加1%酚红当作指示剂[17]，同时在培养基中添加醋酸铊或青霉素类抗生素可以抑制杂菌的生长[23-26]。配制MS 的固体培养基的方法是在液体培养基的基础上添加1.2%的琼脂粉，在5% CO2、37℃的培养箱中培养MS 2～5d，可在100 倍显微镜下观察到典型“煎蛋样”的MS 菌落[11]。MS 的革兰氏染色呈阴性，有时由于染色不佳而无法清晰观察，MS 的姬姆萨染色和瑞氏染色多表现为淡蓝色或紫色的球状体[21]，直径大小约0.2μm，而细菌一般不会被染色[20]。

2 鸡滑液囊支原体病的流行病学调查

鸡滑液囊支原体的主要感染目标是鸡、火鸡以及珍珠鸡[27]，对于其他家禽的危害主要以幼龄禽类为主，哺乳动物体内则很少出现MS，而伊朗某学者也曾从牡蛎体内分离出MS[28]。MS的感染可以全年发生，但由于冬季和春季的天气对鸡群的压力较大[13]，所以在冬春季节MS 的发病率明显上升。不同品种和日龄不会影响家禽的MS感染，但15 日龄、30～40 日龄、60～70 日龄的雏鸡较其他日龄更易受到影响，但随着鸡日龄的增长，抵抗力也会增加。成年鸡也可感染MS，但因为成年鸡对MS 有较强的抵抗力，因此多表现为隐性感染[13]。隐性感染的鸡和发病鸡是该病的主要传染源[29]。目前，全国各地鸡滑液囊支原体病均有报道，血清阳性率逐年上升，且外来品种或品系的发病率比本地品种高[30]。鸡在感染MS 后，潜伏期多为12～21d，在此期间被感染鸡会不断向体外排菌，污染饮用水、饲草、垫料等。MS 主要通过空气经呼吸道进行传播，感染率可达100%，并且目前MS 感染无法完全治愈。蛋鸡感染MS 后产蛋率只有正常情况的60%～80%，最低可降至30%，并且母体感染后，通过生殖道排毒的时间长达14～40d，并经垂直传播感染下一代。世界范围内的多个地区养禽产业的血清学监测到MS 的存在[31]，并且商品代蛋鸡群中MS 的阳性检出率比父母代高，而父母代的MS 的阳性检出率高于祖代。当存在新城疫、鸡传染性支气管炎[32]、大肠杆菌等致病因子与MS混合感染时，会加重鸡的呼吸道症状，其中气囊炎的临床症状会更加严重，有试验发现，感染MS 的同时感染鸡传染性法氏囊[29]，不但会导致法氏囊发生病变加重，而且会使鸡气囊病变更加严重。

3 鸡滑液囊支原体的致病性研究

鸡滑液囊支原体的生长繁殖主要依靠吸收鸡细胞的营养成分，因为MS 的基因组太小，无法合成自身所需的氨基酸、脂肪酸以及辅助因子和维生素等[33]，因此需要从宿主体内吸收前体物质才能合成自己的生物大分子，这种寄生关系的存在会导致鸡体内细胞功能严重受损。精氨酸二水解酶途径能够合成支原体需要的能量物质，在这个过程中鸡体内的精氨酸会被大量消耗甚至耗尽，进而导致蛋白合成障碍[34]。近年来，大量研究发现可变脂蛋白和血凝素蛋白是支原体膜蛋白[35]，在介导机体细胞和逃避免疫的过程中血凝素蛋白担负着重要的作用，氨基端部分脂蛋白和羧基端部分蛋白会在其翻译后暴露出来，而且其抗原变异性的频率较高[36]，抗原差异在不同株的MS 中表现也较明显[37]。由于支原体缺乏细胞壁，在接触到机体细胞后可与机体细胞产生膜并与膜融合，引起细胞膜上某些受体识别位点发生改变，进而对信号在细胞间的传导和细胞因子的生成等产生影响。存在于细胞膜上的受体的功能可能会在支原体吸附于机体细胞后受到干扰[38]，同时支原体还会产生许多对细胞有害的代谢物和溶细胞酶以及超氧自由基等[38]。机体细胞膜上磷脂的水解能够被支原体膜上结合的磷脂酶催化，因此细胞上的信号通路会被干扰，同时宿主细胞膜的完整性会被产生的溶血磷脂破坏。支原体自身无法合成核苷酸，但能合成所需的核酸酶，这些核酸酶合成后能够进入机体细胞并对机体产生负面作用[10]。引起炎性损伤是支原体致病机理的表现之一，在消除支原体的进程中巨噬细胞起很大作用[10]。通常情况下，巨噬细胞想要清除支原体，补体和抗体以及细胞因子的参与是必不可少的[10]。机体在感染支原体的早期，前炎性因子会由免疫细胞诱导产生，这些炎性介质可以诱导白细胞和内皮细胞等的表达和炎性细胞渗出[39]。尽管炎性细胞有利于免疫系统消除支原体，但失控的炎症反应也能加重局部组织的损伤[10]。机体感染支原体能够产生部分特异性抗体IgM 和IgG 以及黏膜表面SIgA 等，这些抗体不能完全清除支原体，会如炎性因子一般易导致反复感染并带来一定的病理损伤。支原体感染人或动物后，T 细胞在对抗病原的过程中起着重要作用。大量的细胞因子可感染支原体后产生，产生细胞因子的功能各不相同，但可导致一系列复杂的协同和拮抗免疫反应。感染支原体也能造成溶血或神经系统病变以及肾小球肾炎等某些自身免疫反应，但目前有关支原体引起的自身免疫性疾病的机制尚不明确[10]。

4 鸡滑液囊支原体病的临床症状

鸡滑液囊支原体可引起鸡的传染性滑膜炎并伴随呼吸道症状，鸡群一旦被MS 感染就难以完全清除[5]。在经呼吸道感染的一周内，鸡开始出现轻微的呼吸打鼾，主要是慢性亚临床症状。天气寒冷时，以呼吸型为主的MS 可引起各种年龄段的鸡气囊病变[40]，并且鸡群在感染MS 后1～2个月内会出现发病高峰[41]。在感染MS 导致传染性滑膜炎的鸡群中，发病早期，有鸡冠呈灰白色，喜卧且走路不稳，精神疲惫不愿站立，采食量下降，营养不良等症状[10,21]。疾病恶化后，鸡群羽毛变得粗糙，鸡冠有萎缩且面部肿胀，部分鸡可见跗关节和脚垫肿胀，病痛严重不敢走动，胸部有积液[10]，患病鸡腿部有发热现象，以手触摸有波动，尤其是肉鸡感染MS 后关节炎症状更加明显并严重影响体重增长。对于患有慢性感染的蛋鸡，鸡群虽然已经感染了MS，但是关节炎的症状却不严重。蛋种鸡感染MS 后可能会导致蛋壳尖端出现缺陷[42]，感染MS 后部分鸡在排泄物中显示出大量的尿酸或绿色尿酸盐沉积[10]。鸡群的MS 急性感染，一段时间后可以缓慢恢复或整个发病期间只显示有少数慢性感染的鸡，无法观察到MS 感染的急性期，但MS 却在整个鸡群中终生存在。此外，当鸡群继发感染新城疫、传染性支气管炎、大肠杆菌病后鸡群死亡率明显增加[43]。鸡滑液囊支原体病不仅能造成鸡的滑膜炎和腱鞘炎等病症，当该病菌与其他细菌混合感染时还造成鸡生长发育缓慢、副产品产量和品质下降[44,45]。感染MS 的鸡死淘率很低，但鸡群中MS 经常会同MG同时感染，加重了病鸡的临床表现，使病情恶化。

5 鸡滑液囊支原体病的诊断

有关鸡滑液囊支原体病的诊断，在临床症状和病理变化的基础上对MS 进行实验室诊断是非常必要的。如果鸡群中有鸡出现跛行的同时，伴有鸡冠苍白，排绿色稀便，体型消瘦，胸部起水疱，尸检后可见脾和肝肿大[21]，可以考虑是MS感染[46]。虽然金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌等也可引起关节炎，但是，可以根据疾病的严重程度和每种疾病的临床症状进行区分[40]。病毒性关节炎也可导致鸡跛行，但感染鸡的主要特征是伸肌腱肿胀，爪垫和关节通常没有肿胀，这些很容易与鸡滑液支原体感染区别开来。此外，来自患有病毒性关节炎的鸡的血清不会凝集MS 抗原。在呼吸系统症状方面，由于本病的呼吸道症状不明显，或有滑膜支原体感染，但无呼吸道症状，因此，呼吸道症状通常不是感染这种疾病的判断基础[10]。此外，检测禽滑液囊支原体的方法有：MS 的分离鉴定、MS 的血清学检测、MS 的分子学检测等[47]。想准确无误地检测出MS病原体可以采用分离鉴定的方法，但是分离鉴定方法的周期太长，无法做到快速鉴定[48]。血清学检 测MS 的方法包括：HI 试 验、SPA 试 验、ELISA 试验等，这些检测方法是临床上经常使用的，可以做到快速检测，但敏感性不理想并且容易出现交叉反应[49]。分子学检测MS 的方法主要是PCR 技术等，该方法有着很好的准确性和特异性，因此，在实验室诊断中经常使用该方法[47]。

6 鸡滑液囊支原体病的预防与治疗

鸡滑液囊支原体一旦在鸡场出现就无法完全根除，在进购幼鸡时就要严格把关，购买无支原体感染史种鸡场的健康雏鸡，并使用全进全出的模式，严格的管理模式，采用良好的饲养环境和合适的饲养密度以及适宜的饲养温度[50]。MS 的防控要坚持以预防为主，控制MS 的发生和流行，将饲养管理和药物预防以及疫苗免疫等密切结合，注重生物安全是防治MS 最主要的的措施[51]。缺乏细胞壁是支原体最大的特点，因此针对细胞壁的抗生素无法对其起到作用[52]。早期体外抗生素敏感试验表明，MS 对大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、喹诺酮类抗生素敏感[53]，进行药物治疗不但能够降低垂直传播的概率，而且能够改善副产品下降的状况[54]。在2013 年的试验中，欧洲和以色列分离出的73 株MS 中，分离株中有59%对恩诺沙星耐药[55]，这说明MS 对喹诺酮类药物的耐药作用正在迅速上升。我国的相关试验表明，替米考星、氟苯尼考、诺氟沙星等对MS均有不同程度的抑制作用[56]。然而伴随着抗生素的大量使用和滥用，部分抗菌药物在清除MS 感染方面再也难以起效[50]。因此，在治疗措施中，最好的方法就是分离本场区的MS 做药敏试验[32,57]，首先了解场区抗生素使用的历史，通过药敏试验筛选出敏感的抗生素，在发病鸡群中选用高敏感药物进行治疗。虽然抗生素的治疗可以减轻MS感染引起的病症，降低部分经济损失，但是不能完全清除病原菌，而且存在抗生素残留和产生耐药性的隐患[50]，因此预防治疗MS 还需进一步研究探讨。

7 鸡滑液囊支原体病疫苗的研究

鸡滑液囊支原体感染一直困扰着全世界，特别是最近几年来更加严重[31,50]，给禽养殖场在生产中MS 的预防和控制带来了很大的麻烦[50,52]。MS对养禽产业带来的严重危害主要体现在自身的免疫抑制和临床症状，同时当该菌与其他病原菌混合感染时，会加重病鸡的呼吸道症状[58]。伴随着养禽产业的快速发展，顽固性的MS 感染越发引起科研人员和养殖者的重视。药物预防与治疗是防控MS 感染的一个重要手段，如果过分依赖甚至滥用药物[59]，就会增加MS 耐药性发生的概率，加大药物在机体中的残留，危害公共卫生安全，因此探索MS 新的防控措施十分重要。虽然接种疫苗无法实现对养殖场内MS 的净化，但疫苗接种依旧是目前防控MS 感染的有效手段，尤其在集约化和分阶段养殖的禽类养殖场中。MS 疫苗的开发可分为三个方向：减毒疫苗、灭活疫苗以及基因工程疫苗。

鸡场的健康养殖除了要求有严格的生物安全和卫生防控措施，还需要依靠合格的疫苗来预防MS 的感染[50]。同灭活疫苗相比，减毒疫苗不仅能够使鸡自身产生免疫抗体对自身进行保护，而且可以持续刺激机体产生抗体起到长期免疫作用。目前世界上已经拥有2 株商业化的活疫苗可以用来预防MS 感染，分别是MS1 疫苗株和澳大利亚的(ts+)MS-H 疫苗株[52,60]，MS1 疫苗株是通过体外不断传代培养而导致本身自然突变的，其生长过程不需NAD 的菌株[60]。澳大利亚的MS-H 株是从感染MS 的蛋鸡中分离到的86079/7NS 株经NTG 诱变获得[61]，该菌株是一株对温度十分敏感的弱毒疫苗，目前可以应用在多种禽类动物上[62]，一般标记为(ts+)MS-H，该疫苗不会对鸡产生致病性，经过免疫后可永久存在于机体内部并预防野毒株感染[50]。然而安全性是活疫苗需要面对的最大问题，活疫苗的使用不利于鸡场MS 的净化，目前不仅美国没有进口(ts+)MS-H 活疫苗，我国使用者也很少[50]。

灭活疫苗和基因工程疫苗目前都还处于研发阶段，有试验表明灭活疫苗接种于上呼吸道能够引起鸡产生有效的血清抗体且不会导致组织器官病变。灭活疫苗在预防鸡MG 感染方面在20 世纪就取得了一定的成果[63]，我国科研人员用MG Rlow 株和MS WVU1853 研发的灭活二联苗，经动物攻毒保护试验证明该苗在半年内能够诱导免疫鸡产生较高的抗体应答且具有持续性，能够起到很好的免疫保护作用[9]。目前在实验室和临床上，澳大利亚的MS 疫苗在安全性和有效性上已经得到了肯定，而国内对MS 疫苗的研发依旧缓慢。从全球对禽类疾病的防控措施来看，无论从免疫的途径和免疫的保护力方面考虑，还是从疫苗的毒力和疫苗的成本等方面考虑，研发出更安全高效的MS 疫苗已经迫在眉睫。

8 小结

鸡滑液囊支原体病是近年来发展较快且对禽类危害较大的一种支原体引起的传染病，被世界卫生组织归为B 类传染病，目前该病的防治主要依靠抗生素，然而伴随着抗生素的大量使用和滥用，部分抗菌药物在清除MS 感染方面再也难以起效，在疫苗研制方面，目前商品化疫苗的发展比较缓慢，产品性质单一，MS 疫苗的研发具有重要意义。鸡滑液囊支原体病的防控要坚持以预防为主，控制MS 的发生和流行，将饲养管理和药物预防以及疫苗免疫等密切结合，注重生物安全是防治MS 最主要的的措施。