口蹄疫病原学及化学发光方法国内外研究进展

肖 敏，肖 蕾，徐峥嵘，薛慧文

（1.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730046；2.兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃兰州 730046；3.甘肃农业大学，甘肃兰州 730070）

1 口蹄疫病原学国内外研究进展

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染性疾病。全世界均有分布，宿主范围广，主要特征是口、鼻、蹄及乳头等部位发生水疱、溃疡、烂斑。该病的致病性和感染性特别强，可快速传播，感染发病率可达100%，使得病畜生产能力下降，畜牧养殖损失惨重。我国将其列为一类动物疫病之首[1]。

1.1 病原

口蹄疫病毒属微RNA 病毒目、微RNA 病毒科、口蹄疫病毒属，此病毒共分为A 型、O 型、C 型、Asia1 型、SAT1 型、SAT2 型和SAT3 型7个血清型，同一血清型还分为不同的基因型，各血清型之间无交叉免疫，给口蹄疫防控带来巨大的困难[2]。口蹄疫由4 个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）组成病毒衣壳蛋白，保护RNA 免遭核酸酶降解，10 个非结构蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D、3AB、3ABC）构成，非结构蛋白的主要功能是参与RNA 复制、多聚蛋白的裂解以及结构蛋白的折叠和装配过程[3]。FMDV 为无囊膜的病毒粒子，病毒衣壳结构是由20 面体组成，VP1、VP2、VP3 位于衣壳 外部，表面有重要的中和抗原表位刺激机体产生抗体。VP1 和VP3 是不对称蛋白，组装成核衣壳保护内部核酸不受伤害。口蹄疫表位研究的重点VP4 位于衣壳内部。

1.2 口蹄疫病毒基因组的结构和功能

口蹄疫病毒基因组为单股正链RNA，约由8500 个核苷酸组成。FMDV 呈球形，为无囊膜的二十面体结构。基因组的5’UTR 较长，最长的约有1300nts，有丰富的二级结构，第一个核苷酸为U，能与VPg 以共价键的形式结合。5’UTR没有帽子结构，有几个十分保守的阅读框，调控着病毒蛋白的合成与RNA 的复制。5’UTR 中还有内部核糖体进入位点，调控着翻译的起始作用。3’UTR 由两部分组成，一部分位于非结构蛋白3D 之后，大约为100 个氨基酸，另一部分为poly（A）结构，主要是RNA 聚合酶3D 识别的信号[4]。口蹄疫病毒C 残基的同聚体位于RNA的S-片段3’测，被称为poly（C）段，这是口蹄疫病毒和大多数病毒基因组的共同特征。poly（C）的长度在不同毒株之间有较大的差异。在口蹄疫病毒RNA 中，有一段序列位于poly（C）和IRES 原件之间，包含着许多假结节，位于poly（C）段的5’端侧，参与poly（C）段的连接功能。

1.3 口蹄疫结构蛋白及其功能

口蹄疫病毒病毒的衣壳是由VP1、VP2、VP3、VP4 等4 种结构蛋白形成的五聚体单位构成的。4 种结构蛋白借助组氨酸聚合成病毒衣壳，决定了病毒在酸性条件下很稳定。结构蛋白中只有VP4 位于核衣壳的内部，VP1、VP2 和VP3 都位于衣壳表面。由于VP1 能使机体产生抗体，达到保护机体的功能并进一步决定病毒的抗原性。VP1 上的G-H 环是细胞表面受体识别的位点，VP1 是最容易变异的蛋白，能引起抗原表位的变异[5]。VP2 具有很好的抗原性，它可以特异性地刺激机体产生抗体。3C 蛋白酶可以使P1 结构蛋白裂解成VP0、VP1 和VP3。病毒衣壳蛋白的主要功能为保护病毒核酸免受核酸酶降解，决定着病毒的抗原性，包装和递呈病毒RNA，决定宿主的范围和组织嗜性等[6]。

1.4 口蹄疫非结构蛋白及其功能

非结构蛋白能由于具有非结构蛋白的反应原性，因此可用于检测口蹄疫病毒。可用于检测的非结构蛋白主要有L、2C、3ABC、3D 蛋白。L蛋白免疫原性较其他蛋白低，产生的抗体持续时间较短，但高度特异，必须结合其他蛋白检测动物是否感染口蹄疫。L 蛋白至少有两种存在形式，Lab 和Lb，它是由框架内密码子AUG 翻译而形成的。口蹄疫病毒的第一次裂解阶段发生在2A的C 末端，形成P1-2A 前体。2A 和2B 序列是-NPG/P-序列，很保守。几乎所有感染口蹄疫病毒的动物都能产生2C 抗体，2C 抗体可在动物体内持续12 个月。口蹄疫的3A 蛋白比其他病毒的3A 蛋白都大，由153 个氨基酸组成，是抑制蛋白分泌的主要蛋白。3B 蛋白是VPg 尿酸化后，是合成RNA 的引物，由3 个相连但大小不同的基因编码。3ABC 蛋白抗体在机体内存在时间较长，感染牛最早3 天时间就可以检出，最长可在机体中存在2 年。目前检测3AB 和3ABC 蛋白抗体是鉴别动物是否免疫和感染口蹄疫病毒的标准。根据报道，2B、3B 和2C 上存在可以用来检测非结构抗体的特异性B 细胞表位。口蹄疫病毒编码序列内的大多数聚蛋白是由3C 蛋白酶负责裂解，在加工的过程中不需要3D 序列发挥功能。

2 化学发光技术及其应用研究进展

2.1 化学发光技术概述

20 世纪60 年代放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），因其灵敏度高和特异性强，迅速得到推广。但由于存在放射性污染，在此基础上Halman 等[7]于1977 年发明了化学发光免疫分析（Chemiluminescence immunoassay，CLIA）。化学发光免疫分析相比荧光免疫分析（Fluorescence immunoassay，FIA）、酶联免疫分析、放射免疫分析具有特异性强、线性范围广、灵敏度高、无辐射、操作简单等优点，被广泛应用于医学、食品分析、农药残留检测等各个方面。

2.2 化学发光剂种类

2.2.1 鲁米诺及其衍生物

鲁米诺（Luminuo）其衍生物是化学发光免疫分析中最早应用的一种化学发光物质。鲁米诺性质稳定，在碱性条件下可被H2O2等氧化剂氧化发生化学反应，出现化学发光。但是，该化学反应较慢，发光时间较短，往往需要给反应体系中加入酶或其他催化剂加快反应速度。酶类主要有辣根过氧化物酶（HPR），无机物有Fe3+、Cu2+、Co2+等。加入这些催化剂后，化学发光强度明显增强，化学发光时间延长。鲁米诺及其衍生物化学发光分析广泛应用于蛋白、核酸等领域。

2.2.2 吖啶酯类

吖啶酯（Acridinium ester，AE）是重要的化学发光试剂。当过氧化氢处于碱性溶液中时，吖啶脂就能迅速发光。具体原理为：处于碱性溶液中的吖啶脂能迅速被过氧化氢氧化，生成不稳定的二氧乙烷，二氧乙烷酮分解成激发态的N-甲基吖啶酮和CO2，当返回到基态时释放出波长约为430nm 的光。吖啶脂作为化学发光试剂不需要催化剂，且具有发光效率高、时间长等优点。

2.2.3 (金刚烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物

（金刚烷）-1,2-二氧乙烷（AMPPD）及其衍生物常应用于化学发光体系，有稳定性高、检测范围广、有效期长等优点。用碱性的磷酸酶（AP）标记抗原或者其他抗体，一并加入（金刚烷）-1,2-二氧乙烷及其衍生物和增强剂，从而引起化学发光。通过测定发光强度，作出标准曲线，确定待测物浓度。

2.2.4 高锰酸钾

高锰酸钾是化学发光体系中最常用的氧化剂之一，它能与还原性的物质发生氧化还原反应，产生激发态物质，激发态返回到基态发生化学发光。由于高锰酸钾化学发光体系较为稳定，现已广泛应用于药物分析、环境监测等方面。可以在酸性溶液中，以高锰酸钾为氧化剂测定对氨基苯甲酸类麻醉剂、肾上腺素、利血平、胡延索乙素、吗啡、海洛因等。

2.3 化学发光分析技术的应用

2.3.1 化学发光分析在农药残留方面的检测

农药广泛应用于病虫害的防治，但是大量使用会造成环境污染和危害人类健康。目前农药残留检测方面最常用方法有液相色谱法、气相色谱法、液相色谱法-质谱法，气相色谱-质谱法等。但由于仪器昂贵，分析时间较长，实验方法较为繁琐。Jin M 等[8]报道的三唑磷的化学发光免疫分析方法，使得三唑磷的最低检测浓度为0.063ng/mL。由于酶联免疫吸附剂测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测最低检测极限达不到农药最大残留限量（MRL）要求，目前化学发光在农药残留方面的检测已经成为研究热点。

2.3.2 化学发光分析在医学中的应用

化学发光免疫分析在医学方面广泛应用。李雨升等[9]采用电化学发光免疫分析技术对98 例前列腺增生患者、99 例前列腺癌患者和136 正常男性患者血清中的前列腺特殊抗原进行测定和统计学分析，结合影像学分析，让前列腺癌的诊断率大大提高。临床上，化学发光免疫分析在药物分析方面也有广泛应用，如用于检验地塞米松、心得安、盐酸多巴胺、阿托品、多贝斯等药物。如DPC 的IMMULITE 全自动CLIA 系统，该试剂盒能对心脏病、甲状腺功能、传染病、糖尿病等疾病进行检测，还可以对血清、药物和肿瘤标记物进行检测。

2.3.3 化学发光免疫分析在生物毒素检测方面的应用

化学发光免疫分析方法已在生物毒素中广泛应用，如检测葡萄球菌肠毒素、黄曲霉毒素、伏马菌素等。虽然化学发光免疫分析具有较高的灵敏度，但仍需要开发，提高稳定性。Magliulo等[10]在化学发光免疫分析技术的基础上，建立了牛奶中黄曲霉毒素M1 免疫分析检测方法。将黄曲霉毒素M1 的偶联物包被在化学发光板上，加入相应的抗体和待检测物质，最后加入酶标二抗，实现对黄曲霉毒素M1 的定量检测。

2.3.4 化学发光免疫分析在食品方面的应用

化学发光免疫分析在食品原料安全检测领域得到广泛应用，尤其在食品添加剂、违禁物、调味食品的原料检测当中得到应用。Ding 等[11]用化学发光免疫分析方法实现了对食醋原料苹果和梨中盐碱类农药氯噻啉的快速检测，线性范围为0.13～5.84ng/mL，与其他方法相比灵敏度高，线性范围更广。三聚氰胺是一种有机化工原料，危害人的生命健康安全，被有些不法分子用来提高乳品中氮含量。曾华金等建立了流动注射化学发光法来检测牛奶中三聚氰胺的含量。在碱性溶液中，使用三聚氰胺能和鲁米诺-过氧化氢化学发光体系建立快速检测牛奶中三聚氰胺的方法。在最优的条件下，检测范围为0.2～80μg/mL。检测过程中没有发生交叉反应，结果可靠。

食品中病原微生物能引起食物腐败变质，并可导致人食物中毒甚至危害生命安全。现阶段的病原微生物检测方法较为繁琐，耗时长，不能满足快速检测需要。目前，基于化学发光免疫分析技术实现了对大肠杆菌的检测，能做到快速准确，显著降低检测的时间。郭小英等[12]用化学发光磁酶免疫法检测大肠杆菌，极大地提高了大肠杆菌的检测速度。

2.3.5 化学发光分析在环境中的应用

由于气相化学发光分析法具有较高的灵敏度，被作为英国官方分析方法，并被美国国家环境保护署用于检测原油中含氮化合物和大气中臭氧。世界卫生组织检测系统也将化学发光分析法列为检测大气中氮氧化合物的标准方法。

2.3.6 化学发光免疫分析在兽医产科方面的应用

国外已出现检测雌激素、促黄体生成素、催乳素等生殖激素的相关化学发光免疫分析试剂盒，可以快速、大量检测生殖激素。对生殖激素的不定期检测可以保障家畜的正常生殖和发育，对畜牧业具有重大意义。

2.3.7 化学发光免疫分析在病原检测及疾病诊断中的应用

（1）结核病的化学发光检测方法

阳幼荣等[13]用CLIA 和ELISA 结核病试剂盒检测血清中的抗体，并对结果进行分析，发现260 例肺结核患者中检出率分别为71.2%（185/260）和58.5%（152/260），说明在结核抗体检测中，CLIA 试剂盒的灵敏度显著高于ELISA 试剂盒。

侯英等[14]用化学发光酶免疫分析对结核病的全血γ-干扰素进行定量检测，可以检测到pg/mL（10～12pg/mL）水平的γ-干扰素，为诊断结核杆菌感染提供了、稳定、快速、灵敏度高、特异性强的检测方法。与传统的PPD 皮肤实验相比较，对393 名新入伍的战士进行结核杆菌病的筛查，结果显示PPD 试验的阳性率为46.6%，全血γ-干扰素的阳性率为21.6%，两种方法的一致率为60.8%。全血γ-干扰检测方法可以提高结核杆菌敏感性和特异性，可以成为一种新的检测结核杆菌的方法。

（2）单核细胞增生李斯特氏菌的化学发光检测方法

范龙兴[15]等人将抗单核细胞增生李斯特氏菌的兔多抗与磁性微球偶联构建了免疫磁分离原件，并应用双抗夹心法ELISA 检测李斯特氏菌全菌抗原，应用化学发光免疫法进行定量检测，建立标准曲线，确定了李斯特氏菌的浓度。化学发光检测标准曲线拟合优度为0.954，最低检出限为10～4CFU/mL，特异性良好。

（3）梅毒的化学发光检测方法

杨璐[16]用磁性微粒与化学发光联用建立的化学发光磁酶免疫分析法，用来检测血液中梅毒螺旋体，极大地提高了检测的灵敏度，该方法操作简单，发展前景很广，值得推广。该方法主要形成抗原-抗体-酶标抗原双抗原夹心复合物后，加入化学发光底物和辣根过氧化物，通过化学发光仪捕捉发光信号，实现对梅毒螺旋抗体的检测。方阵实验最终确定抗原包被量为每孔210ng/mL，抗原稀释度为1∶3000，HPR 稀释液为PBST+1%BSA，血清稀释液为PBS+0.1%BSA。该方法检测80 例梅毒抗体阴性血清，阴性符合率为100%，相比较商品化的梅毒化学发光试剂盒，灵敏度提升了4 倍。该方法具有很好的灵敏度和线性范围，有很好的应用前景。

（4）猪细小病毒病的化学发光检测方法

周媛[17]用化学发光免疫方法检测猪细小抗体，与传统方法相比具有操作简便、线性范围广、检测成本低等优势。最优条件下，血清稀释度为1∶80，检测其他病阳性血清，不存在交叉反应。该方法与猪细小病毒病ELISA 试剂盒比较，特异性为87.5%，敏感度为93.3%，检测效率为90%。结果表明，该方法可以应用到临床当中去。

（5）人类登革热病毒的化学发光检测方法

朱天川[18]用化学发光免疫分析法建立了快速检测人类登革热病毒的方法。相比传统的PCR 法和血清法，操作简便，灵敏度和特异性高。包被抗原的浓度为10μg/mL，血清稀释为1∶400，酶标二抗的稀释度为1∶160000。该试验共检测176 临床标本，结果显示，化学发光检测方法具有较高的灵敏度和特异性，能把疟疾感染和自身免疫病区分开，具有很好的应用前景，对人类登革热病疫苗的研发具有一定的意义。

（6）乙肝表面抗原化学发光检测方法

结合我国乙肝病毒感染的现状，反应快、灵敏度高、特异性高的检测方法的建立尤为重要。蒋玲莉[19]建立了化学发光法诊断乙肝表面抗原的方法。马超[21]用化学发光和磁分离技术，建立了快速、高通量、实用的肝炎分子检测技术。通过对体系中多个条件的优化，检测结果可靠。也可以应用到其他疾病的检测。

3 小结

随着科学技术的不断进步，化学发光免疫技术已经应用到各个领域，尤其在农业、医疗、食品、工业、生物等领域，取得了显著的成果。但化学发光在口蹄疫的应用很少有报道，相比酶联免疫吸附剂测定及其他检测方法，化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便、耗时短等优点，有望代替传统的ELISA 检测方法。因此，本文对化学发光免疫技术进行综述，以期能探索建立一种能够快速检测口蹄疫病毒并能区分口蹄疫疫苗免疫动物与自然感染动物的方法，为FMDV 的诊断提供一种新的方法，实际解决目前FMDV 诊断中存在的问题。