牛成纤维细胞体外分离培养方法

时间：2024-05-30

李欣淼，张子敬，张格阳，张志浩，闵佳，王香南，朱进华，施巧婷，祁兴山，祁兴磊，张志鹏，徐美芳，高留涛，李若玺，黄永震，王二耀*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西西安 712100；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；3.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450002；4.河南省动物检疫总站，河南郑州 450008；5.泌阳县夏南牛科技开发有限公司，河南泌阳 463700）；6.河南省鼎元种牛育种有限公司，河南郑州 451454）

结缔组织最主要的细胞成分为成纤维细胞（Fibroblasts，Fbs），对于分泌细胞外基质成分、构建细胞外基质及组织创伤修复发挥了十分重要的作用，也被称为纤维母细胞[1,2]。典型的Fbs 形状为细长状或梭形，当细胞贴壁后主要呈现为梭形，细胞之间松散排列，细胞形态随培养基和培养密度的改变而有所改变[3]。作为最易培养的细胞之一，Fbs 的增殖能力很强，生长速度快[4]。动物的Fbs 来源广泛，包括皮肤、腺体和睾丸组织等[5-10]。近年来，随着Fbs 体外分离培养技术的不断完善，Fbs 在人[11]、猪[12]、绵羊[13]、牛[14]和犬[15]等不同动物上均在体外成功分离培养[16]。由于Fbs体积大、数量多，增殖分裂能力强，易获取，在关于疾病研究的相关模型的建立、功能研究、胚胎等多个方面被广泛应用[1,2,10,17-20]。

目前，在资源保护、转基因技术以及动物模型等方面体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术被广泛应用，被认为是良种快速扩繁的最直接的手段之一[2]。通过体细胞核移植技术获得的重组胚能完整地继承亲本性状，相对于体外受精技术来说，实验周期短，将体细胞的细胞核注入去核卵母细胞中获得重构胚，并通过胚胎移植技术将重构胚胎移植到受体母畜的子宫，经发育可获得与供体动物遗传信息一致的克隆子代[21]。到目前为止，SCNT 的相关技术已较为成熟，在品种资源保护及医学方面都获得了很好的成果[2,22]。目前已有研究表明，移植能否成功的关键取决于供体细胞的质量，供体细胞的最佳选择之一为成年牛的耳缘Fbs[2,23]，因此，移植前期的工作重点是如何分离培养Fbs。在培养过程中，由于原代细胞不断地进行复制和分裂，细胞不可避免地会发生衰老，不能在细胞培养过程中实现无限培养和使用。因此，需要不断地进行技术比较和更新，从而快速获得细胞，延长细胞的使用寿命[24-26]。本试验通过组织贴壁法培养细胞以及组织贴壁+双酶消化法（胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ）分离细胞，比较两种培养方法的目的是在短时间可以分离出成纤维细胞，且分离出的细胞存活率高，状态良好，同时也为提高牛体细胞核移植效率提供前期试验依据。

1 材料

1.1 试验动物

试验动物选自鼎元种牛育种有限公司，取10头生产性能好的成年种公牛的耳缘组织。

1.2 主要试剂

胎牛血清（FBS）、DMEM 培养基均购自Gibco。0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、DPBS、PBS、双抗（青链霉素混合物，PS）均购自索莱宝。

完全培养基为DMEM+15%FBS+2%PS，细胞消化液（DMEM+025%胰蛋白酶+2%双抗；DMEM+025%胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ），由河南省农业科学院畜牧兽医研究所养牛实验室配制。

1.3 主要仪器

二氧化碳培养箱（Thermo），荧光倒置显微镜（Nikon），离心机（湘仪），摇床（旻泉，MQL-61R）。

2 方法

2.1 耳缘组织获取及处理细胞培养

固定好牛后用肥皂水打湿耳朵，清洗，用刮刀逆向将耳朵正反的毛发刮去，越干净越好。用75%的酒精棉球对耳神经和血管较少的部位消毒3 遍。用缺耳钳剪下大小约为1～2cm3的组织块（每剪下一只需要用75%的酒精对耳缺钳进行消毒），碘伏止血。将取下的组织先在75%的酒精中清洗两遍，再在含有1%PS 的DPBS 中清洗2遍。将清洗好的组织块放在含1%PS 的DPBS 中低温（4℃）带回实验室。在含有1%PS 的DPBS中清洗组织块，并将剩余毛发、表皮皮肤和脆骨去除。

2.2 牛耳成纤维细胞分离培养

2.2.1 组织块贴壁培养法

在含有1%PS 的DPBS 中将处理好的组织剪成合适大小（1～2mm3）的碎块。将血清均匀涂于培养皿底部（35mm，1mL），将处理好的组织转移到培养皿（60mm）中，于37℃、5% CO2培养箱中干涸培养5～8h。干涸培养后小心缓慢的加入1mL 完全培养基。24h 后补加2mL 完全培养基，2～3d 更换一次完全培养基。

2.2.2 双酶消化法

将处理好的组织块剪碎（0.5～1mm3），将剪碎的组织转移至15mL 离心管中，1000r/min 离心1min 后弃上清。加入DMEM、1%PS 以及0.25%胰蛋白酶，置于37℃、5%CO2培养箱中，每5min 振摇一次，共20min。振摇后1000r/min 离心5min，弃上清。加入0.25%胰蛋白酶和胶原蛋白酶Ⅱ（3 ∶1），封口膜封口，在37℃摇床210r/min 进行消化直至出现白色透明絮状物（约1h 时会出现白色透明絮状物）。将絮状物吸至含有完全培养基的培养皿（60mm）中，于37℃、5%CO2培养箱中培养[2]，2～3d 更换完全培养基一次。

2.2.3 细胞传代及纯化

弃去培养皿中的旧培养基，加入1mL PBS 润洗，弃去PBS。加入2mL 温好的0.25%胰蛋白酶，于37℃培养箱中消化2～3min，直至细胞由梭形变为圆形。当大部分细胞出现形态改变后，快速用移液枪吹打，直至细胞全部脱落，立即向培养皿中加入体积为胰酶2～3 倍的DMEM 进行终止[2]。用15mL 离心管收集细胞悬液，1200r/min 离心3min，只留沉淀物。使用完全培养基重悬细胞，将细胞转移至新的培养皿中，摇匀，放在37℃、5%CO2培养箱中培养，第2 天看细胞是否贴壁；每24h 或48h 进行换液，待细胞汇合到90%左右进行传代。传代2～3 次即可得到纯化的Fbs[2]。

3 试验结果

3.1 组织贴壁法对细胞生长的影响

由图1 可知，使用组织贴壁法培养时，细胞从组织中迁移出来的速度较慢，培养至第6 天时，组织块边缘有圆形细胞游出，培养至第10或11 天时，可观察到长梭形细胞，Fbs 形态明显，培养至16d 时，细胞形态密集生长，呈现涡旋状。

图1 不同培养时间组织块贴壁法培养的原代牛耳成纤维细胞（100×）

3.2 组织贴壁+双酶消化法对细胞生长的影响

由图2 可知，相较于组织贴壁法，组织贴壁+双酶消化时细胞迁移速度较快，第4 天即可观察到有圆形细胞从贴壁组织边缘迁移出来，第5 天可在组织边缘看到梭形并伸展的Fbs（极少量），第6 天可以看到大量细胞迁移贴壁生长，培养至第10 天时可见涡旋状生长晕。

图2 不同培养时间组织块贴壁+双酶消化法培养的原代牛耳成纤维细胞（100×）

3.3 成纤维细胞传代及纯化

由图3 可知，传代后，细胞的生长力未受到影响，增殖能力和原代细胞相差不大。在胰蛋白酶作用后，细胞呈团状圆形细胞贴壁。将细胞进行传代，发现与原代细胞相比，传代细胞形态上没有明显改变。当细胞贴壁后可以观察到细胞的胞质饱满。

4 讨论

Fbs 生长速度快，且取材方便、快捷、易培养，目前有许多生物技术的直接材料都来源于Fbs，并且采集后对动物并不会产生较大影响[1,2,28]。通过Fbs 的培养，进行体细胞核移植是保护稀有、濒危、优良品种和大型物种遗传物质的有效措施[27]。作为核移植（NT）相关实验的主要供体细胞，在良种保护和快速扩繁上能直接影响最终的移植效果[2,29,30]。目前组织贴壁法和酶消化法为细胞原代体外分离培养的主要方法[2,31,32]。组织贴壁法操作简单、操作时所用时间短，但是在培养过程中组织容易贴壁不牢且细胞迁移速度慢耗时长[33]；组织贴壁+双酶培养法操作时间长、成本较高，但在培养过程中细胞迁移速度快且生长速度较组织贴壁法快。胶原酶又称胶原蛋白水解酶（Collagenase），它能在适宜pH 和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构[34]，而不损伤其他蛋白质和组织，对细胞的损伤较小，但长时间消化后细胞也仍不能完全脱离盘底[6]。胰蛋白酶消化细胞的能力强，但对细胞的损伤较大[5]，两种酶混合后，胰蛋白酶的浓度会有所降低，对细胞损伤也会减小，能在较短的时间里获得大量的细胞[2]。本试验选取鼎元种牛育种有限公司的10头优质种公牛的耳组织，通过比较2 种培养Fbs的方法以期高效地得到成纤维细胞。通过Fbs 的培养和获取后续进行成纤维体细胞核移植，能将生产性能良好的种公牛资源进行保存。试验结果表明，使用组织贴壁+双酶培养能缩短细胞迁移和培养时间，且所获得的细胞在传代后生长状态依旧良好。