高效液相色谱法同时测定农药产品中 溴敌隆和溴鼠灵顺反异构体

马红青，肖 峥，史福霞

(上海市质量监督检验技术研究院，上海 201114)

溴敌隆(bromadionlone)和溴鼠灵(brodifacoum)是我国常用的2种水溶性抗凝血杀鼠药，因其灭鼠效果好，对人畜毒性低，近年来在我国得到认同并普遍使用。该类老鼠药的生产企业较多，若管理不到位，会造成生产区域及周边环境的污染。因此，建立快速高效的检测方法十分必要[1]。

目前，国内外对于抗凝血杀鼠药的分析测定方法主要有紫外分光光度法、气相色谱法、薄层色谱法[2]、液相色谱法[3]、气相色谱-质谱法[4-6]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)[7]等，尚未见报道用液相色谱法同时测定农药中的溴敌隆顺反异构体(分别为溴敌隆A和溴敌隆B)、溴鼠灵顺反异构体(分别为溴鼠灵A和溴鼠灵B)。本文通过对前处理条件和高效液相色谱条件的优化，建立了农药产品中溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A、溴鼠灵B的高效液相色谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(DAD)(美国安捷伦)；BSA224S-CW型电子分析天平(梅特勒-托利多)；SK8210HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；Milli-Q Reference型超纯水机(密理博)，0.45 μm有机滤膜(上海安谱)。

溴敌隆、溴鼠灵标准品(质量分数不小于98.0%，江苏泛华进出口有限公司提供)；甲醇、乙腈、二氯甲烷(色谱纯，Fisher)；磷酸(分析纯，沪试)；试验用水为超纯水；配制pH=3的磷酸水溶液[8]，作为液相色谱用流动相B。甲醇与二氯甲烷混合溶剂：甲醇∶二氯甲烷=3∶2 (体积比)[9]。

1.2 液相色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱温30 ℃；流动相A为乙腈，B为pH=3的磷酸水溶液，流量为1.0 mL/min，梯度洗脱程序：A为60%，保持20 min；20.1 min，A由60%升至80%，保持10 min；25.1 min，A由80%降至60%。检测波长：265 nm (0~16 min)，254 nm (16.1~30 min)。进样量5 μL。

1.3 标准溶液的配制

标准储备溶液(5 000 mg/L)的配制：分别称取0.05 g (精确至0.1 mg)溴敌隆和溴鼠灵于10 mL容量瓶中，溴敌隆用甲醇溶解定容，溴鼠灵用甲醇与二氯甲烷混合溶剂溶解定容，冷却至室温。

混合标准溶液的配制：用以上标准储备溶液，以甲醇作为溶剂逐级稀释，配制成浓度为5、10、20、50、100、500 mg/L的混合标准溶液。

1.4 试验方法

称取农药试样1.0 g (精确至0.1 mg)置于25 mL容量瓶中，加入甲醇约20 mL，超声提取5 min，冷却至室温后，摇匀。用0.45 μm有机相过滤器过滤上清液，按液相色谱条件进行测定。标准溶液同时按液相色谱条件进行测定。

用外标法计算农药试样中溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A、溴鼠灵B的含量。

若被测物响应值超过线性范围，则减少称样量或稀释样品溶液，保证响应值在线性范围内。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相的选择

考察了甲醇-水(pH=3的磷酸水溶液)、乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流动相体系，发现用甲醇-水(pH=3的磷酸水溶液)流动相体系时，溴敌隆和溴鼠灵异构体均不能分离，而用乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流动相体系时，溴鼠灵和溴敌隆异构体均能有效分离。

同时优化了乙腈-水(pH=3的磷酸水溶液)流动相体系的流量和梯度洗脱程序，流动相A为乙腈，B为pH=3的磷酸水溶液，流量为1.0 mL/min，梯度洗脱程序：A为60%，保持20 min；20.1 min，A由60%升至80%，保持10 min；25.1 min，A由80%降至60%。检测波长：265 nm (0~16 min)，254 nm (16.1~ 30 min)。0~16 min内，检测器波长设为265 nm，16 min后检测器波长设为254 nm，从溴敌隆和溴鼠灵的紫外吸收光谱图可见，265 nm和254 nm分别为溴敌隆和溴鼠灵的最大吸收波长，确保目标物为最大响应。在以上洗脱条件下，目标物均能完全有效分离，且峰形良好，溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A、溴鼠灵B混合标准溶液色谱图见图1。

2.1.2 检测波长的选择

对溴敌隆和溴鼠灵标准溶液分别进行紫外扫描，得到其相应的吸收波长与响应值的紫外吸收光谱图(图2和图3)。溴敌隆和溴鼠灵的最大吸收波长均在265 nm处，因此检测波长选择265 nm。

图3 溴鼠灵紫外吸收光谱图

2.2 方法的线性关系

分别对混合标准溶液按1.4节试验方法进行测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，得到溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A、溴鼠灵B检测的线性范围均为5~500 mg/L。由于样品前处理是将1.0 g试样稀释至25 mL，因此换算成样品中各目标物的含量应为125~12 500 mg/kg。各有效成分质量浓度与其响应值之间表现出良好的线性相关性，其相关系数均大于0.999，见表1。

表1 分析方法的线性参数

2.3 方法的检出限

将浓度约为5 mg/L的标准溶液进行重复测定10次，计算其信噪比的平均值，再根据定量限为10倍信噪音时被测物的浓度(CS/N=10)，检出限为3倍信噪音时被测物的浓度(CS/N=3)。由于样品前处理是将1.0 g试样稀释至25 mL，计算得到溴鼠灵A、溴鼠灵B、溴敌隆A、溴敌隆B的定量限和检出限(表2)。

表2 分析方法的检出限

2.4 方法的准确度

对农药样品进行加标回收率试验。分别加入125、1 250、12 500 mg/kg共3个水平的混合标准溶液，每个加标水平平行测定7次，在上述色谱条件下计算加标回收率，结果见表3。可见，3个浓度水平下，方法的平均加标回收率为93%~106%，说明该方法回收率高，准确度好。

表3 分析方法的回收率

2.5 方法的精密度

在上述色谱条件下对同一份农药样品进行7次独立平行测定，以考察该方法的精密度，结果见表4。可见，农药样品中溴敌隆A、溴敌隆B、溴鼠灵A和溴鼠灵B的标准偏差分别为1.05、1.89、1.60、2.41，变异系数分别为0.08%、0.15%、0.13%、0.19%，说明该方法的精密度良好。

表4 分析方法的重复性

3 结 论

本文采用高效液相色谱仪建立了同时测定农药产品中溴鼠灵顺反异构体，溴敌隆顺反异构体的方法。该检测法前处理方法简便易行，线性范围可达125~12 500 mg/kg、检出限125 mg/kg、重复性良好，可适用于农药产品中溴鼠灵顺反异构体和溴敌隆顺反异构体的检测分析与质量控制。