苯氧菌胺原药液相色谱分析方法研究

徐成辰，吕 霞，杨淑娴，吴 晗

(江苏省农产品质量检验测试中心，南京 210036)

甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是近10多年来具有很强发展潜力和市场活力的一类低毒、高效、广谱的内吸性杀菌剂，对几乎所有的作物真菌性病害有良好的活性，在世界杀菌剂市场中占据重要地位[1-2]。苯氧菌胺(metominostrobin)是日本盐野义制药公司开发的一种新颖甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，其主要通过抑制病原菌线粒体的电子传递而使菌体死亡，目前主要登记用于水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、芸豆等作物的多种病害例如水稻稻瘟病、稻纹枯病、黄瓜白粉病、瓜类灰霉病、瓜类等霜霉病的防治，尤其是对水稻稻瘟病的防治有特效[1]，表现出广谱、高效、无交互抗性、低毒、低残留等特点。

目前关于苯氧菌胺的研究，主要集中于其合成路线优化[3]以及原药与制剂国内登记，但是尚无相关标准发布和分析方法的研究报道。为了满足企业生产质控的需求，同时为市场监管等工作做前期准备，本文采用高效液相色谱技术建立了一种适用于苯氧菌胺原药中有效成分定量分析的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

Agilent-1100型高效液相色谱仪配二极管阵列紫外检测器及色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；超纯水制备系统(默克密理博公司)；AS3120B超声清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；针筒过滤器，0.45 μm滤膜(默克密理博公司)。

1.2 试剂和溶液

乙腈，色谱纯(德国Merck公司)；超纯水；苯氧菌胺标准品，已知质量分数含量≥99.9%(江苏中旗科技股份有限公司)；苯氧菌胺原药，已知质量分数含量≥97.0% (江苏中旗科技股份有限公司)。

1.3 色谱操作条件

色谱柱为Zorbax SB-C18不锈钢色谱柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈+水=50+50 (体积比)；流动相流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为230 nm；进样体积为2 μL。在上述色谱条件下，苯氧菌胺的保留时间约为5.0 min。苯氧菌胺标准品、苯氧菌胺原药的高效液相色谱图分别见图1、图2。

图1 苯氧菌胺标准品液相色谱图

图2 苯氧菌胺原药液相色谱图

1.4 质量分数测定步骤

1.4.1 配制标准品溶液

准确称取苯氧菌胺标准品0.02 g (精确至0.000 01 g)，置于50 mL容量瓶中，添加45 mL乙腈，超声振荡5 min，使标准品完全溶解，冷却恢复至室温，用乙腈定容，摇匀。

1.4.2 配制原药试样溶液

准确称取含苯氧菌胺的试样0.02 g (精确至0.000 01 g)，置于50 mL容量瓶中，添加4 5 mL乙腈，超声振荡5 min，使试样完全溶解，冷却恢复至室温，用乙腈定容，摇匀并用0.45 μm过滤器过滤。

1.4.3 进样测定

按照以上操作条件，在仪器基线稳定后，连续进行标准品溶液进样，直至连续2针峰面积的变化小于1.2%后，以标准品溶液、试样溶液、试样溶液、标准品溶液的次序进样并分析计算。

1.4.4 质量分数的计算

分别将连续测定2针试样溶液及试样前后标准品溶液的峰面积算平均值，并按以下算式计算苯氧菌胺的质量分数(X)。

式中：m1为苯氧菌胺标准品的称样质量，g；m2为试样的称样质量，g；F1为标准品溶液的苯氧菌胺峰面积平均值；F2为试样溶液的苯氧菌胺峰面积平均值；r为标准品中苯氧菌胺质量分数，%。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

按1.4.1节配制苯氧菌胺标准样品溶液，利用高效液相色谱仪的二极管阵列检测器进行紫外光谱扫描(190~400 nm)，所得苯氧菌胺的紫外吸收光谱图见图3。可见，苯氧菌胺在195 nm、230 nm处分别有紫外吸收峰值。考虑检测波长越大，容易产生紫外吸收的杂峰越少，故选择230 nm作为检测波长。

图3 苯氧菌胺紫外吸收光谱图

2.1.2 流动相的选择

选用安捷伦Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱进行分析，经初步摸索比较常用流动相用有机溶剂，发现选择乙腈/水体系，1.0 mL/min流速时，苯氧菌胺可以得到比较好的分离效果。以此为基础，将不同比例的乙腈/水混合并分别试验，当有机相占比过大时，保留时间短，导致苯氧菌胺和杂质峰分离不好；而当有机相占比过小时，保留时间太长，影响峰形和检测效率。根据苯氧菌胺和杂质峰的出峰时间、分离效果、峰形以及峰纯度进行综合考虑，当使用乙腈+水=50+50 (体积比)时，苯氧菌胺色谱峰峰形及峰纯度较好，且能兼顾杂质分离度与分离效率，保留时间在5.0 min (图1)。

2.2 特异性试验

本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别苯氧菌胺。分别配制标准品溶液和试样溶液按1.3节操作条件进行峰纯度测试。测定结果表明，标准品和原药两者中的有效成分峰纯度均高于99%，无其他杂质成分干扰，满足定量分析的要求。峰纯度色谱图见图4~图5。

图4 苯氧菌胺标准品HPLC-DAD峰纯度色谱图

图5 苯氧菌胺原药HPLC-DAD峰纯度色谱图

2.3 方法线性关系的测定

按照标准品溶液的配制方法制备5个不同浓度的苯氧菌胺标准品溶液，并进行线性测定。按1.3节操作条件，分别测定每个标准品溶液的苯氧菌胺峰面积，2次测定取平均值。以有效成分质量浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标绘制线性关系图，见图6。

图6 苯氧菌胺的线性关系图

从图6可以发现，在191.81~1654.34 mg/L质量浓度范围内，苯氧菌胺的质量浓度与对应的峰面积线性关系良好，其线性回归方程为y=6.613 6x+180.14，相关系数为0.999 8，可以满足定量分析的要求。

2.4 方法精密度的测定

按照试样溶液的配制方法制备5个苯氧菌胺原药的样品溶液，在1.3节操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标准品溶液、精密度溶液、精密度溶液、标准品溶液的顺序进行精密度测定，结果见表1。

表1 苯氧菌胺原药中苯氧菌胺精密度试验结果

从表1可以看出，苯氧菌胺原药中苯氧菌胺质量分数测定结果的RSD为0.24%，而修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.34，RSD测定结果远小于公式计算值，表明此分析方法的精密度测定结果能够满足定量分析的要求。

2.5 方法准确度的测定

为了验证方法的准确度，进行了有效成分的回收率试验。称取含0.01 g (精确至0.000 01 g)苯氧菌胺的苯氧菌胺原药于50 mL容量瓶中，再加入苯氧菌胺标准品0.01 g (精确至0.000 01 g)，按照试样溶液的配制方法制备了5个有效成分准确度溶液。在1.3节操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标准品溶液、准确度溶液、准确度溶液、标准品溶液的顺序进行测定，准确度测定结果见表2。

表2 苯氧菌胺原药的准确度试验结果

从表2可以看出，苯氧菌胺原药中苯氧菌胺平均回收率为99.29%，说明有效成分分析方法准确度较好，测定结果符合定量分析的要求。

3 结 论

本文采用高效液相色谱仪和紫外检测器建立了一种测定苯氧菌胺含量的分析方法，采用Zorbax SB-C18色谱柱、流速为1.0 mL/min的乙腈/水等体积混合溶液为流动相，在检测波长为230 nm下进行分离测定。该方法具有操作简便快速，线性关系良好，特异性、精密度、准确度较高、有效成分分离效果良好等特点，可用于苯氧菌胺原药常规分析和质量控制。