秦薯5号甘薯茎尖分生组织培养脱毒及种苗快繁技术研究

秦静远, 朱渭兵

(1.杨凌职业技术学院,陕西 杨凌 712100;2.杨凌金薯种业科技有限公司, 陕西 杨凌 712100)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]属于旋花科甘薯属，是甘薯属的一个栽培种，在中国种植分布广泛。进入21世纪，中国甘薯种植面积常年在5×106hm2左右，是我国重要的粮食、饲料作物和工业原料[1]。秦薯5号是宝鸡市农业科学研究院与西北农林科技大学联合选育，为优质鲜食蒸烤和淀粉加工兼用型甘薯品种。薯块干物率33.08%，淀粉含量69.14%(干基)，粗蛋白1.11%(鲜薯)，可溶性糖5.03%。秦薯5号在陕西省内常年种植面积约4万hm2，约占全省甘薯种植面积的50%，为本省甘薯主栽品种[2]。甘薯属无性繁殖作物，主要通过块根、茎蔓、秧苗进行繁殖。在生产中，甘薯病毒病是影响甘薯产量和品质的主要因素之一。近年来危害重的病害SPVD是由甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)双重感染和协同互作引起[3]，显症植株的产量比健康植株减少79%～86%，严重影响产量和经济效益，对甘薯种苗生产和产业发展危害较大。笔者研究利用茎尖分生组织培养技术繁育秦薯5号脱去SPVD 2种病毒的脱毒种苗，以提高甘薯产量和品质。

1 材料与方法

1.1 供试品种为秦薯5号甘薯

种薯由杨凌金薯种业科技有限公司甘薯种苗繁育基地提供。挑选特性完全符合秦薯5号的块根，清洗干净，浸蘸0.1%的甲基托布津溶液，种植于经高温灭菌的泥炭与珍珠岩(2∶1)混合基质中，设置温度为28℃催芽，出芽后设置温度为38℃16 h，27℃8 h。处理10 d后切取2 cm长茎稍，剪去叶片，自来水冲洗30 min，经75%酒精浸泡10～15 s，有效氯浓度为2%NaClO溶液(150 mL加1滴洗洁精)浸泡灭菌20 min，无菌水冲洗3次后，浸在无菌水中备用。

1.2 茎尖剥离与培养

在超净工作台上，用无菌滤纸吸去材料表面水分，置于体视显微镜下，用镊子固定材料，用解剖针小心剥去顶芽外层幼叶，露出茎尖分生组织，用手术刀尖小心切取0.3～0.5 mm含有2～3个叶原基的茎尖接种到芽诱导培养基上。培养基以MS+IAA0.2 mg/L+GA30.05 mg/L+蔗糖3.0%为基础，附加6-BA 0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L，pH 5.8。每个培养基分15支试管，每管接1个茎尖。培养基为液体状态，以滤纸桥方式培养，外植体放在滤纸上高出培养基液面约5 mm处。

在上述培养基上诱导出的芽分别编号，转接至MS+NAA0.01mg/L+蔗糖3.0%+琼脂0.6%，pH5.8的培养基上培养，待长至5～6片叶后，以1节1段转接入相同培养基中继续培养，进行病毒检测和增殖培养基筛选。

各培养阶段的温度设为23±2℃，光照时间14 h/d，光强为2 000 Lx，光源为LED灯管。

1.3 病毒检测

采用NCM—ELISA方法进行SPFMV和 SPCSV 2种甘薯病毒检测[3]。取不同株系试管苗的叶片，研磨后将汁液点于硝酸纤维素膜上，按照试剂盒使用说明书上步骤进行操作，肉眼观察病毒检测结果。若样品是阳性，会在膜上形成鲜明的色斑，阴性则没有颜色反应。

1.4 试管苗增殖培养

试管苗以无菌短枝扦插方式繁殖。在无菌条件下，试管苗以2节1段接种在增殖培养基上。增殖培养基以MS+NAA0.05 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%，pH5.8为基础，附加6-BA0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L，以不加6-BA为对照。每个处理20瓶，每瓶接5个材料。28 d后测量叶片数，株高，根数，根长，生根率等生长状态指标。

1.5 壮苗生根培养

以1/2MS+蔗糖2%+琼脂0.6%为基础，附加NAA，浓度分别为0.01、0.05、0.1 mg/L，以不加NAA为对照。21 d测量根长、根数等生长状态指标。

1.6 试管苗炼苗移栽

把长有5～7片叶，根系发达试管苗的培养瓶移至人工气候室中，打开瓶盖，注入少量自来水，瓶中水面高于培养基1 mm左右，光照度5 000 Lx，温度25℃，湿度85%，2 d后湿度调整为70%。4 d后洗去试管苗粘附的培养基，将试管苗栽植至泥炭与珍珠岩(2∶1)混合基质中。基质使用前，按7 00 g·m-3的用量加CaCO3调节pH，将pH由5调至6左右。

2 结果与分析

2.1 不同生长调节剂对甘薯茎尖分生组织芽诱导的影响

接种后的茎尖分生组织，1d后即有部分外植体发褐死亡，其余的继续培养全部形成愈伤组织，没有出现细菌和真菌污染。50d后部分愈伤组织上长出1芽，均无芽丛形成，另一部分愈伤组织无芽形成。茎尖形成的芽在愈伤组织上生长缓慢，转切下入上述MS+NAA0.01 mg/L+蔗糖3.0%+琼脂0.6%培养基上能较快生长。

不同生长调节剂组合对茎尖分生组织芽诱导率影响较大，在6-BA浓度在0.1～0.5 mg/L范围时，随着浓度提高，芽诱导率也在提高，当6-BA浓度为1.0 mg/L时，外植体形成的愈伤组织会较快增大，而芽诱导率下降。MS+6-BA0.5 mg/L+IAA0.2 mg/L+GA30.05 mg/L有利于茎尖分生组织诱导成芽(表1)。

表1 不同生长调节剂组合对甘薯茎尖分生组织芽诱导的影响

2.2 试管苗病毒检测

采用NCM—ELISA方法进行SPFMV和 SPCSV 2种甘薯病毒检测，各株系试管苗SPFMV,SPCSV 2种病毒检测结果均为阴性。

2.3 不同生长调节剂组合对试管苗增殖的影响

6-BA浓度相对较低时促进试管苗生长，随着6-BA 浓度的提高，在浓度0.5～2.0 mg/L时，秦薯5号试管苗株高增加缓慢，并在苗基部出现了愈伤组织，在6-BA 2.0 mg/L时有玻璃化苗出现。MS+6-BA0.1 mg/L +NAA0.05 mg/L适合于继代增殖培养(表2)。在以后的增殖培养中，使用相同培养基，以2节1段的方式进行无菌短枝扦插，约30 d为1个周期，增殖系数可达5.8。

表2 不同生长调节剂组合对秦薯5号试管苗快繁的影响

2.4 不同浓度NAA对生根的影响

试管苗生根以NAA0.01 mg/L为宜，提高NAA浓度试管苗生长过快，节间过长，茎叶色淡绿，试管苗有透明趋势。在NAA 0.1 mg/L时，在苗基部出现明显愈伤组织，影响根的诱导和生长(表3)。

表3 不同NAA浓度对秦薯5号试管苗生根的影响

2.5 试管苗炼苗

试管苗炼苗后，洗去粘附的培养基移栽至装有混合基质穴盘中，浇透水后喷施0.1%的普力克溶液，保温保湿，试管苗成活率可达98%以上。

3 结果与分析

甘薯块根经高温催芽处理后，剥取的秦薯5号0.3～0.5 mm包含2～3个叶原基茎尖组织，在MS+6-BA0.5 mg/L+IAA0.2 mg/L+GA30.05 mg/L+蔗糖3%液体培养基上具有较高的芽诱导率。剥取的茎尖越小,成活率越低,这与Q.C.Wang研究一致[5]。每个外植体脱分化形成的愈伤组织仅能诱导出1芽，没有形成丛生芽，这说明此芽应是外植体原有的茎尖分生组织长大而成，而不是由外植体脱分化形成的愈伤组织经再分化形成的不定芽。

在免疫定位技术的敏感范围内，SPCSV没有达到甘薯茎尖第5叶原基，而SPFMV在第4叶原基中可以检测到，在更幼嫩的叶原基中不具有维管组织发育的解剖特征[6]。试验中剥取包含2～3个叶原基的茎尖分生组织诱导形成的苗，引起SPVD病害的2种病毒SPMMV,SPCSV检测为阴性，说明这两种病毒没有侵染到茎尖的第2至3叶原基。但是否会因检测敏感范围的影响，在以后的试管苗扩繁过程中出现病毒再次积累，则需要定期的检测。

在脱毒试管苗增殖培养中，6-BA浓度在0.5～2.0 mg/L,时叶黄化现象会升高，这与陆展正在京薯6上的研究结果一致[4]。秦薯5号试管苗适宜在MS+6-BA0.1 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%培养基上增殖培养，繁殖倍数可达5.8，1/2MS+NAA0.01 mg/L+蔗糖2%+琼脂0.6%培养基可诱导根的发生，且苗健壮,可以快速繁殖出大量甘薯脱毒试管苗。脱毒试管苗经炼苗后移栽至灭菌的混合基质中，保温保湿防菌，成活率可达98%以上。