福建省漳州市罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及毒力基因和耐药性研究

袁 橙，陈怀君，袁 圣，温华茂，陈智怡，董洪燕，封 琦，郭长明

(1.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300；2.广西大学动物科学技术学院，南宁 530004；3.福建恒兴饲料有限公司，漳州 363108)

罗非鱼养殖在国内发展迅速，已成为继中国四大家鱼之后的第五大养殖鱼种。据《中国渔业统计年鉴2019》统计，2018年中国罗非鱼淡水养殖产量为162.5万t，比2017年增长4万t。随着养殖规模的扩大，罗非鱼养殖环境管理和控制却未能同步保障，导致每年7～10月份无乳链球菌病等频繁暴发，制约了中国罗非鱼养殖业的健康发展[1-3]。

无乳链球菌感染宿主范围广泛，不仅会引起鱼类败血症、奶牛乳腺炎，而且能引发新生儿败血症、脑脓肿等严重疾病[4]。中国流行的无乳链球菌血清型主要为Ⅰa型[5]，其发病机制包括菌体黏附与侵袭细胞、菌体释放毒素和宿主不适当的免疫应答等[6-7]。无乳链球菌的许多毒力因子与致病机制相关。当感染宿主时，病原菌选择性表达的多种毒力因子共同配合引发疾病。已有研究证实，约30种毒力因子与无乳链球菌的致病性有关[8]。其中，cylE基因编码的β-溶血素是无乳链球菌表面相关的多功能毒素，可促进细菌在宿主体内扩散，引起心脏、肝脏功能衰竭等；sodA基因编码的超氧化物歧化酶有助于细菌适应宿主体内的氧化应激环境；gapC基因参与编码的三磷酸甘油醛脱氢酶与无乳链球菌黏附宿主细胞有关；scpB基因编码的C5a肽酶可分解和灭活人类补体成分C5a，帮助细菌逃避免疫系统的清除。目前鱼无乳链球菌病尚无有效疫苗可用，多数养殖场应对该病的主要措施仍是投喂抗生素，导致鱼源无乳链球菌耐药性日趋严重。

为了解福建罗非鱼主养区无乳链球菌病流行特征，江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室从福建省漳州市部分地区罗非鱼养殖场分离无乳链球菌，通过对分离菌株进行血清型鉴定、主要毒力基因鉴定和药敏试验，以期明确福建罗非鱼主养区无乳链球菌的生物学特性，为防治鱼类无乳链球菌病提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2020年8月上旬，江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室从福建省漳州市某罗非鱼养殖场采集泳姿异常(如翻滚式或呈原地转圈式游动)，或出现眼球突出混白等症状罗非鱼的脑组织、眼球内容物、肝脏等作为待检病料。

1.2 主要试剂

无菌绵羊血购自南京鼎周生物科技有限公司；THB培养基购自BD公司；琼脂粉购自OXOID公司；细菌基因组提取试剂盒、DNA纯化试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；DL2000 DNA Marker、PCR 2×TaqMix均购自南京诺唯赞生物技术有限公司；药敏纸片和生化反应管均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；其余试剂为进口或国产分析纯。

1.3 细菌分离培养与形态学观察

取病鱼脑组织、眼球内容物及肝脏组织，划线接种于TSB血平板进行细菌分离，37 ℃过夜培养，次日观察菌落形态及溶血特性。挑取白色、表面光滑湿润、边缘整齐的优势菌单菌落接种TSB液体培养基，37 ℃培养至对数生长期，取适量菌液进行革兰染色，用油镜对分离株进行形态学观察。

1.4 分离株的生化鉴定

从分离株纯培养物中挑取单个典型菌落，参照生化反应管说明书进行VP试验、CAMP试验、触酶试验、海藻糖和山梨醇发酵试验、马尿酸盐和七叶苷水解试验。

1.5 细菌分子生物学鉴定

1.5.1 菌株PCR鉴定 将生化鉴定为阳性的分离株在THB血平板上进行三区划线纯化菌株，37 ℃培养18 h后，挑取单菌落于THB液体培养基中，置于摇床180 r/min、37 ℃恒温培养至对数生长期。利用菌液PCR快速检测阳性菌株。根据文献[9]合成无乳链球菌16S rDNA特异性片段引物(上游引物：5′-GAGTTTGATCATGGCTCAG-3′;下游引物：5′-ACCAACATGTGTTAATTACTC-3′)，引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成。PCR反应体系15 μL：菌液 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TaqMix 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共34个循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5.2 细菌DNA提取 将PCR检测阳性菌株分别接种于8 mL THB培养基中，置于摇床180 r/min、37 ℃恒温培养6 h。按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，并保存于-20 ℃，用于16S rDNA通用引物PCR进一步鉴定。

1.5.3 分离菌株16S rDNA鉴定 根据文献[10]合成细菌16S rDNA通用引物(上游引物：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3′；下游引物：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成。PCR反应体系50 μL：DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×TaqMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应条件同1.5.1。序列预期扩增长度为1 500 bp。取2 μL扩增产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。用DNA纯化试剂盒对符合预期条带的部分扩增产物进行纯化，寄送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.6 分离株血清型鉴定

参照Imperi等[11]基于荚膜多糖基因序列设计的无乳链球菌血清型鉴定引物，合成19条特异性引物(表1)，引物均由苏州金唯智生物技术有限公司合成。以无乳链球菌参考菌株人源株NEW316、牛源株ATCC 13813、鱼源株GD201008-001作为阳性对照，多重PCR鉴定分离株的血清型。

从历史来看，15世纪的西方人充满了一种敢于冒险的精神，以超乎寻常的方式探索着未知的世界。葡萄牙人航海探险的规模虽然难以与东方世界郑和下西洋的规模相比较，但它也是那个历史性的时刻，一个海上技术与通道迅速发展、连接整个世界的时刻，一个西方亨利王子紧抓机遇、东方皇帝拒绝机遇的时刻，成了决定西方主宰世界的时刻。西方的冒险迸发了诸类治理文明，而这些文明又迅速扩展，成为其主宰世界的有力工具。

PCR反应体系20 μL：DNA模板 1μL，2×TaqMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O补至20 μL。PCR反应条件同1.5.1。反应结束后取2 μL产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 分离株毒力基因的检测

为检测分离菌株的主要毒力基因，根据文献[12]合成4个无乳链球菌主要毒力基因SodA、cylE、gapC和scpB引物，引物信息见表2。以无乳链球菌参考菌株人源株A909、牛源株ATCC13813、鱼源株GD201008-001作为阳性对照，同时以ddH2O为模板做阴性对照，分别PCR扩增以上4种毒力基因。PCR反应体系15 μL：细菌基因组DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TaqMix 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，退火(温度见表2)15 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后，取2 μL产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 毒力基因检测引物

1.8 药敏试验

根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的K-B法，测定各分离株对29种抗菌药的敏感性。取150 μL新鲜的目的菌液涂于直径90 mm的THB平板，贴药敏片后37 ℃恒温培养15 h左右，测量抑菌圈直径。依据抑菌范围说明书进行药敏结果判断。

2 结 果

2.1 临床症状

病鱼表现为食欲减退，游动姿势不平衡或呈圈样打转，眼球突出肿大，眼角膜浑浊，眼眶四周轻微出血。剖检各脏器伴有不同程度的水肿，病鱼肝脏肿大并呈纤维素样变，胆囊肿大、颜色较深、胆汁充盈。

2.2 形态学观察

将分离菌株划线接种血琼脂平板，37 ℃培养24 h后，菌落特征为：白色圆形、边缘整齐、表面光滑湿润，呈β溶血(图1)。革兰染色后，油镜下分离株为典型的革兰阳性球菌特性，菌体呈蓝紫色，菌体排列为长短不一的链状，单个或成对存在(图2)。共分离获得14株分离菌。

图1 分离株菌落特征

图2 分离株革兰染色镜检图(1 000×)

2.3 生化鉴定结果

生化鉴定结果发现，14株分离株VP试验、CAMP均为阳性，触酶试验阴性，能发酵海藻糖，不能分解山梨醇和马尿酸盐，七叶苷水解试验均为阴性，符合无乳链球菌的生化特性。

2.4 特异性片段PCR扩增及16S rDNA鉴定结果

将生化试验鉴定阳性的14株分离菌株用特异性片段引物均扩增出大小为220 bp的目的条带，部分分离株特异性片段引物快速鉴定结果见图3。

M,DL2000 DNA Marker;1,GD201008-001;2,阴性对照;3～9,部分分离菌株。图4同

以各细菌基因组DNA为模板，16S rDNA通用引物扩增结果显示，获得大小为1 500 bp的目的片段(图4)，与预期的条带大小相符，测序结果经BLAST比对，与无乳链球菌相似度高于99%，进一步证实14株分离菌株均为无乳链球菌。

图4 部分分离株16S rDNA PCR鉴定

2.5 血清型鉴定

以已知血清型的参考菌株GD201008-001、ATCC 13813、NEW316为阳性对照，采用多重PCR鉴定目的菌株的血清型，结果见图5。由图5可知，所有分离菌株的血清型均为Ⅰa型，与阳性对照菌株GD201008-001一致，呈现2个目的条带680和270 bp。

M，DL2000 DNA Marker;1，GD201008-001(血清Ⅰa型);2，ATCC 13813 (血清Ⅱ型);3，NEW316 (血清Ⅲ型);4，阴性对照;5～18，分离菌株

2.6 主要毒力基因的检测

以已知毒力基因的参考菌株GD201008-001、ATCC 13813、A909为阳性对照，扩增各分离菌株的主要毒力基因。cylE(697 bp)、sodA(528 bp)及gapC(222 bp)3种毒力基因的检出率为100%。14株分离菌株均未检测出毒力基因scpB(1 270 bp)，该毒力基因仅在参考菌株人源无乳链球菌A909中检出。部分菌株毒力基因检测结果见图6。

①A～D，分别为毒力基因cylE、sodA、gapC和scpB。②M，DL2000 DNA Marker;1，GD201008-001;2，ATCC 13813；3，A909;4，阴性对照;5～11，部分分离株

2.7 药敏试验结果

由表3可知，14株分离菌株对甲氧胺嘧啶、磺胺异噁唑、氟罗沙星、多黏菌素B及氨基糖苷类药物敏感率为0，且耐药率均达50%以上。但对氯霉素类、β-内酰胺类、大环内酯类、利福霉素类、林可胺类药物的敏感性为100%。

表3 分离菌株药物敏感性试验结果

2.8 多重耐药分析

由图7可知，14株分离菌株均呈多重耐药现象，耐药数量为4到8重，其中6重及以上耐药的菌株11株，占总分离菌株数的78.57%。

图7 分离株多重耐药分析结果

3 讨 论

从福建省漳州市部分渔业养殖场采集眼球混白突出、眼眶轻微出血、游动姿势呈圈样打转或偏向一侧等病症的罗非鱼病料，从病鱼的脑、肝脏和眼部分离病原菌。纯化结果发现，分离菌菌落在THB血平板上为圆形乳白色，表面光滑，呈β溶血。由16S rDNA特异性片段引物初步鉴定及16S rDNA通用引物扩增后测序比对，共获得14株无乳链球菌。

研究表明，鱼源、人源和牛源无乳链球菌分子血清型主要包含Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型3种[13-14]。国内分离菌株的血清型主要为Ⅰa型，Ⅰb和Ⅲ型较少。对14株分离菌株的血清型进行鉴定，发现血清型均为Ⅰa型，与对照菌株GD201008-001相同。此次在福建地区分离得到的菌株血清型，与江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室同期在海南、广西地区分离得到的无乳链球菌血清型相同[15-16]，均为Ⅰa型。方伟等[17]研究显示，广东省部分罗非鱼养殖区感染的无乳链球菌血清型均为Ⅰa型，与本试验结果一致，进一步证实国内罗非鱼无乳链球菌的优势血清型是Ⅰa型。

无乳链球菌中多种毒力因子作用于机体，导致宿主产生一系列病症。本研究检测的毒力基因包括cylE、sodA、gapC和scpB，检测结果与江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室同期在福建、海南、广西3个地区分离获得的76株无乳链球菌主要毒力基因检测结果完全吻合，这些分离株均含毒力基因cylE、sodA和gapC，而缺少毒力基因scpB[15-16]。马芳等[18]检测结果显示,分离株血清型也均为Ⅰa型，同时gapC和cylE基因阳性；Kayansamruaj等[19]研究显示，cylE基因阳性率为100%，但scpB基因序列在Ⅰa 型无乳链球菌的基因组中不存在。以上国内相关研究成果均与此次研究符合，提示scpB基因可能不是Ⅰa 型罗非鱼无乳链球菌的主要毒力基因，所以检出率低。

研究发现，福建地区无乳链球菌对β-内酰胺类、氨苄青霉素、强力霉素、四环素等药物敏感，此结果与王巧煌[20]研究结果一致。谢海花[21]研究显示，福州地区无乳链球菌对青霉素G、氨苄青霉素、万古霉素有较高的敏感率，与本研究结果相符。将此次福建地区药敏结果与江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室分离得到的海南、广西地区无乳链球菌的药物分析结果进行比较[15-16]，3个地区的分离菌株均对磺胺异噁唑、庆大霉素、链霉素、新霉素4种药物表现高耐药率，对红霉素、利福平、克林霉素、β-内酰胺类药物的敏感率高。福建、海南和广西3个地区分离株的不同之处包括：①福建、广西地区菌株还对卡那霉素有较强的耐药性，但海南地区菌株对卡那霉素敏感性高达93%；②海南地区菌株对复方新诺明呈现高耐药率，但福建、广西地区菌株对该药敏感性较强。以上对比结果显示，3个地区的渔业养殖户对抗生素的选用大致相似，进一步分析造成3个地区分离株耐药性差别的原因可能有：①3个地区的分离株有不同的遗传背景，对某些药物的敏感度不同[22-24]；②部分养殖户长期使用某种药物，病原菌毒力基因、耐药基因的表达可能发生变化，诱导病原菌耐药性的产生，造成抗生素“失效”；③养殖环境的差异，如水体硬度、pH及金属离子的含量等[25]，这些因素均对药效有一定影响。明确各地的无乳链球菌的耐药规律，对指导用药、制定合理防控措施具有重要的指导意义。

调研和采样中发现，许多罗非鱼养殖户一味追求提高养殖密度，忽视养殖环境控制，使鱼体长期处于应激状态、免疫力下降，感染细菌性疾病的风险增加。规范养饲养管理，保障水产品质量安全迫在眉睫[26]。当前，使用抗生素仍是控制罗非鱼无乳链球菌病的主要手段，养殖户应提高科学用药意识，通过药敏试验筛选国家允许使用的有效药物，精准治疗罗非鱼链球菌病。随着渔用抗生素禁用种类的不断增加，寻找替代抗生素疗法对防治罗非鱼无乳链球菌病也有重要意义，如研制疫苗、使用抗菌肽及中草药防治方法等[27-29]。

4 结 论

本研究从福建省漳州市发病罗非鱼中分离获得14株无乳链球菌，血清型均为Ⅰa型。毒力基因cylE、sodA、gapC检出率均为100%，未检出毒力基因scpB。14株分离菌株均呈多重耐药，磺胺异噁唑、庆大霉素、卡那霉素等耐药率>70%，氯霉素类、β-内酰胺类、大环内酯类等敏感率为100%。