绵羊骨代谢相关基因VDR密码子偏好性分析

马建青，杨清芳，宋占锋，贾丁丁，吴东蔚，莫秀芳，徐增年，杨 克，吴占勇，籍 颖，周荣艳

(1.华北医疗健康集团邢台总医院骨科实验室，邢台 054000；2.邢台市动物疫病预防控制中心，邢台 054001；3.华北理工大学护理与康复学院，唐山 063210；4.河北医科大学实验动物学部，石家庄 050017；5.河北农业大学，保定 071001)

目前已明确维生素D(vitamin D,VD)在机体内主要是由VD受体(VD receptor,VDR)介导而发挥其生理学效应。VD化学本质为环戊烷多氢菲类化合物，在名义上虽属于脂溶性维生素的家族成员之一，但其本质为类固醇一种激素前体，真正发挥生物学功能的活性形式为1,25(OH)2D3[1]。VDR作为一种重要的核内转录因子，在靶细胞内与VD形成激素-受体复合物作用于靶基因的特定DNA序列上发挥生物学效应[2]。最为经典和被广泛研究的是其参与机体钙磷平衡的调节机制，如对肠道、骨骼、肾脏及甲状旁腺等组织的调节作用，维持骨组织矿物质平衡[3]。众所周知，骨矿盐代谢失衡可引发骨质疏松症、骨关节炎、椎间盘退变、骨软化症及肌肉减少症等多种骨代谢相关疾病。目前，VDR在动物医学及动物遗传学领域的研究较多，如Santillán等[4]发现小鸡骨骼肌细胞中1,25(OH)2D3可以促进钙离子内流；余晓丹等[5]发现大鼠体内锌缺乏可直接改变VDR的活性并影响VDR基因mRNA转录水平，从而影响钙结合蛋白基因转录，进而影响钙吸收，最终导致骨生成障碍；赵家荣等[6]成功建立了VDR基因敲除小鼠品系；Plum等[7]通过低钙喂食方法构建了VD缺乏大鼠模型，利用切除卵巢(OVX)的基本无骨吸收能力大鼠模型研发出一种新型具有强化骨合成代谢活性的1,25(OH)2D3类似药物，为治疗骨质疏松等代谢性骨病提供了新的方法；Miao等[8]综述了利用纯合子转基因(VDR-/-)小鼠和(1α(OH) ase-/-)小鼠模型研究钙的肠吸收、骨化三醇的肾磷酸盐代谢、骨化三醇与骨稳态及骨矿盐体内代谢等生理机制，较为全面地探讨了VD活性代谢物骨化三醇的作用范围、作用机制和VD/VDR信号途径的调控机理。

目前，对VD/VDR分子途径导致骨代谢相关疾病机制研究多集中在啮齿类、鸡等小动物模型上[8-9]，而在密码子水平对绵羊等实验大动物VDR基因的研究报道相对较少。绵羊作为一种体型与骨骼较大的哺乳动物，性情温顺，对饲养环境适应性强，有着与人类较为接近的脊柱形态和结构。相对于小动物，用绵羊做骨代谢疾病建模更易于手术操作和观察[10]。本研究通过对绵羊和其他14个物种VDR基因密码子偏好性及其影响因素进行分析，以期为预测VDR基因潜在功能、表达水平和基因的异源表达提供重要的理论依据，同时为研究VDR基因进化规律及其在转录、翻译过程中的调控机制提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 VDR基因序列来源

通过检索GenBank数据库发现，目前已有880个关于VDR基因CDS区核苷酸序列物种分类单元。本研究选取了脊索动物门中绵羊、大猩猩、鸸鹋和褐家鼠等来自偶蹄目、灵长目、鸟类和啮齿目的15个物种VDR基因CDS序列(表1)。

表1 VDR基因CDS序列信息

1.2 方法

1.2.1 同义密码子相对使用度计算 同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)通常用来衡量某一种特定密码子在编码对应氨基酸的同义密码子间使用的相对概率。RSCU临界值为1，RSCU值>1，有较高使用度；RSCU值=1，未表现出偏好性；RSCU值<1，使用频率较低。该项参数利用CodonW软件计算获得。

1.2.2 密码子碱基含量、用法分值、用法频率、有效密码子数、最佳密码子使用频率和密码子偏好指数计算 GC含量(GC、GC3s)、密码子第3位上A/T碱基含量(A3s、T3s)和密码子第1、2位上GC含量及其平均值(GC1、GC2、GC12)的计算均通过CodonW软件和EMBOSS工具中CUSP(http:∥emboss.bioinformatics.Nl/cgi-bin/emboss/cusp)获取，其中GC含量和GC3s值是对密码子在碱基使用上表现出偏倚性的重要反映参数，若它们同时>0.5，则表示该基因倾向于使用G、C的程度高。在多肽链翻译过程中，参与编码某一氨基酸的各密码子所占比例之和为1，通常以用法分值(Fraction)表示某一密码子在编码时所占比例，用法频率(Frequency)值表示某一种密码子在编码基因所有密码子数中出现的频率值，即在1 000个密码子中出现的次数。ENc值即有效密码子数(effective number of codons)，能反映出在某个基因中全部用到的密码子种类，取值范围为20

1.2.3 ENc-Plot关联分析 以GC3s值为横轴、ENc值为纵轴绘制散点图。如果不同物种的基因参数点位于标准曲线上或附近，则提示基因突变为密码子偏好性的主要影响因素；若各基因参数点落在曲线下方或更远处，提示自然选择压力对密码子偏好性作用更为凸显[15]。

1.2.4 中性绘图分析 以GC1和GC2的平均值GC12为横轴、GC3s值为纵轴绘制散点图。若显示各基因参数点的斜率趋近于1，说明突变为影响密码子偏好性使用的主要原因；若斜率向0趋近，则提示自然选择为其主要影响因素[11,16]。

1.2.5VDR基因的聚类分析 利用DNAMAN 8.0软件对15个物种VDR基因CDS序列(FASTA格式)进行多重序列比对，删除各物种间多余不齐的核苷酸种类，序列同一性达90.09%；利用邻接距离矩阵法进行聚类分析，并构建系统进化树。

2 结 果

2.1 绵羊VDR基因CDS区密码子偏好性分析

由表2可知，所有密码子中有25个密码子RSCU值均>1，除参与编码脯氨酸(Pro)的CCA和终止密码子TGA外，其他23个密码子均是以G、C为第3位碱基，且这些密码子所对应Fraction和Frequency值相对偏高，在编码对应氨基酸时个数也最多；有2个密码子RSCU值=1，分别是编码蛋氨酸/甲硫氨酸(Met)的ATG和编码色氨酸(Trp)的TGG，提示无使用偏好；对RSCU值<1的密码子进行分析，37个密码子大多以A、T结尾，它们的Fraction和Frequency值也偏小。

表2 绵羊VDR基因CDS区密码子偏好性分析

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2.2 绵羊和其他物种VDR基因CDS区各密码子偏好指标分析

绵羊VDR基因ENc值为38.84(>35)，GC和GC3s值同时>0.5，A3s和T3s的数值明显小于GC3s值，Fop值>0.5且CBI值>0；综合分析各物种的ENc值取值范围在32.72～44.77之间，平均值为39.13，GC、GC3s、GC1、GC2、GC12、A3s、T3s、Fop和CBI值等各项数据在各物种间比较整齐，相互之间相差不大，表现出和绵羊VDR基因密码子使用的相似特征(表3)。

表3 不同物种VDR基因的密码子偏好性参数

2.3 不同物种VDR基因RSCU数据分析

所研究的15个物种VDR基因中，RSCU值均>1的密码子有21个(以密码子名称下方标记“XXX”)，这些密码子(除终止密码子TGA外)均是以C/G为第3位碱基，分布于除半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸/甲硫氨酸和色氨酸以外的16种氨基酸中，为共同偏好使用的密码子；同时发现24个密码子(以密码子名称下方标记“XXX”)的RSCU值均<1，它们的第3位碱基基本为A/T，提示它们的使用频率相对较低。由于蛋氨酸/甲硫氨酸和色氨酸仅由1个密码子编码，因此不表现出任何偏好性。比较特别的现象是TGC(编码半胱氨酸(Cys))在褐家鼠中没有使用偏好性，而在其他物种中均具有较高使用度；GGG(编码甘氨酸(Gly))是除鸸鹋、褐家鼠、小鼠和原鸡外其他物种共同偏好性使用密码子；CAC(编码组氨酸(His))是除鸸鹋外其他物种的偏好性使用密码子；CCG(编码脯氨酸(Pro))和TCG(编码丝氨酸(Ser))为鸸鹋和(或)麻雀VDR基因偏好性使用；CCA(编码脯氨酸(Pro))仅为绵羊和山羊VDR基因偏好性使用(表4)。

表4 不同物种VDR基因的RSCU值

续表

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2.4 ENc-Plot关联分析结果

基于表3中GC3s和ENc值(GC3s值为横坐标、ENc值为纵坐标)绘制ENc-Plot关联分析坐标图(图1)，发现散点均落在远离标准曲线略下方，提示自然选择压力可能是导致不同物种VDR基因密码子偏好性使用的主要影响因素。

图1 ENC-Plot关联分析曲线Fig.1 ENc-Plot correlational analytic curve

2.5 中性绘图分析

GC3的变化和GC12的增长不存在正相关性(斜率为-0.0031，R2=0.0004)，同ENc-Plot关联分析图对比显示，与突变压力相比，选择压力为不同物种VDR基因密码子使用偏好性的主要力量(图2)。

图2 中性绘图分析曲线Fig.2 Neutrality plot analytic curve

2.6 聚类分析

通过构建系统进化树(图3)并基于2.5中RSCU数据分析发现，绵羊和山羊来源于同一支，总变异值较为接近，二者的RSCU值也趋于一致；人和黑猩猩虽起源于同一进化分支，RSCU值基本接近，但是大猩猩对GGG密码子有着较高偏好性，人与之相反；小鼠和褐家鼠的总变异值仅相差0.003，但是二者对TGC密码子的使用偏好性也完全相反；大猩猩和黑猩猩虽不在同一分支，但它们的总变异值相同，在RSCU值上也趋于一致；羊驼和野猪的总变异值相同，RSCU值利用性相一致，但是羊驼和牛、山羊、绵羊的进化比野猪更为接近；鸸鹋虽和原鸡进化上很接近，但是在编码组氨酸和丝氨酸时对CAC、TGG的利用表现出独有的非偏好性特点；麻雀单独分支，总变异值也最大，对CCG密码子的使用也与其他物种差异较大。

每条进化分支末尾的数值为物种的总变异值The end of the value is the total variation of the species图3 各物种VDR基因CDS区的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of VDR gene CDS in different species

3 讨 论

蛋白质编码是一个较为复杂的过程，某一物种或某种基因在编码时通常对一种或多种特定的密码子有偏好使用的特点，这种生物学特征即同义密码子的使用偏好性[17-18]。针对某种功能基因做密码子偏好性研究对于基因表达具有重要意义，但是密码子偏好程度会受到基因自身碱基组成结构、染色体中基因位点、基因长度、翻译起始效应及种属差异等诸多因素干扰[11,19-25]。

随着对VDR基因功能研究的深入，其在机体胃肠道保护、发挥抗炎症效用、维持正常的胰岛素分泌和糖耐量等多种疾病中的生理机制逐渐被报道[26-27]。郭勋等[28]通过在饲料中添加不同浓度的VD3发现，VD3/VDR对幼鱼生长及病原体识别分子Toll样受体具有重要的调控作用，而VD/VDR在机体中参与钙磷代谢、维持骨矿物质稳态是其最经典的生物学作用。本研究发现，绵羊VDR基因的使用偏好密码子多以G/C为结尾，23个密码子包括GCC、TGC、GAC、GAG、TTC、GGG、GGC、CAC、ATC、AAG、CTG、CTC、AAC、CCC、CAG、CGG、CGC、AGC、TCC、ACC、GTG、GTC及TAC，这些密码子的Fraction和Frequency值相对较高，初步判断它们为偏好性使用密码子；而参与编码脯氨酸的CCA和终止密码子TGA的RSCU值虽>1，但在编码脯氨酸的4个密码子中，密码子CCC对应的RSCU值更大(1.82)，因此在参与编码时更具优势。这种特点在分析山羊VDR基因密码子时同样存在，而在其他物种中无类似表现，推断可能与VDR基因表达与偶蹄目羊亚科物种特异性有关。对终止密码子TGA偏好使用的现象不仅表现在绵羊VDR基因中，在其他物种中其RSCU值(3.00)均>1。针对TGA出现几率偏高的现象，Sun等[29]曾报道该现象在较为复杂的真核生物中尤其在脊椎动物体内表现更为突出。本研究结果与上述研究结果较一致。进一步对密码子偏好指标等各项参数计算发现，绵羊VDR基因密码子使用偏好整体程度偏低，GC含量大于AT含量，对以G/C结尾的密码子使用偏好程度更强。通过对各物种VDR基因密码子偏好性参数综合分析，绵羊及其他物种的使用偏好性整体上具有一致性，同时表现出了对以G/C为第3位碱基的密码子更为偏好性使用的现象。为进一步明确造成该现象的原因，试验进行了ENc-Plot关联分析和中性绘图分析，结果表明，自然选择压力可能是导致绵羊等不同物种VDR基因密码子偏好性使用的主要影响因素，提示VDR基因多态性的发生可能与之有关[30]，继而为后期骨代谢疾病模型VDR基因表达水平研究提供了线索。

生物进化是物种最本质的特征之一，在进化过程中，物种对密码子的使用模式是其进化的重要证据体现。通过对绵羊及其他各物种VDR基因RSCU数据综合分析结合物种系统进化树发现，物种间总变异值相同或相近且汇聚于同一进化树分支时，其密码子使用偏好性基本一致，但是在个别密码子使用时仍存在差异；而物种间总变异值虽相近或相同，其RSCU值也相类似，但有可能分属不同的进化分支；总变异值同其他物种差距较大的麻雀在系统进化树上独自分支，它在密码子偏好性使用上也显现出独有的特点。由此提示，物种间种属差异会对密码子偏好性使用产生一定程度的影响，同时由于基因结构、长度及碱基组成等因素，对密码子偏好性使用的作用也需加以关注，在动物骨代谢疾病遗传学领域未来发展中应重要关注此方面研究，从而为生物进化、生物多样性及揭示相关疾病在不同动物中的发病特点提供新的研究方向。

VD/VDR信号通路在调控机体钙磷代谢和骨矿盐平衡中发挥着极为重要的生理作用，多种疾病的发生与之密切相关。目前对绵羊等体型较大实验动物VDR基因密码子偏好性分析鲜见报道。本研究通过分析绵羊VDR基因CDS区密码子偏好性使用并与其他多个物种相比较，结果为人们利用绵羊这种大动物模型研究骨质疏松、软骨病等骨代谢相关疾病提供参考，具有一定的理论和现实意义。

4 结 论

通过对绵羊及来自偶蹄目、灵长目、鸟类和啮齿目的15个物种VDR基因密码子偏好性使用进行比较分析，以G/C结尾的密码子为VDR基因优势密码子，导致密码子偏好性使用的主要因素为自然选择作用，多物种RSCU数据分析和系统进化树显示出密码子偏好性使用存在物种特异性，并与物种亲缘关系进化具有关联性。