DHEA诱导小鼠PCOS模型过程中性激素的变化规律

翁 钰，王 琴，赵玉芬，于 凯，郝绍瑜，于泊洋，杜晨光，苏布登格日勒，李海军

(1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区基础兽医学重点实验室，呼和浩特 010018；3.内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特 010110)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种高度异质性疾病，也是育龄女性最常见的一种生殖内分泌紊乱性疾病。PCOS被定义为卵巢功能异常综合征，其最显著的临床表现为卵泡发育障碍、稀发排卵或不排卵、高雄激素表现和卵巢多囊性改变[1]，同时也与肥胖、2型糖尿病和心血管疾病患病风险的增加密切相关[2]。PCOS造成的排卵障碍机制一直是生殖医学的研究热点之一。尽管PCOS病因迄今仍没有完全阐明，但是当前理论公认，雄激素异常升高是PCOS病理诊断中最为恒定的特征，也是造成患者卵泡发育阻滞的核心因素[3-4]。值得注意的是，雄激素对于正常卵巢卵泡发育也至关重要。研究表明，睾酮可通过刺激卵泡刺激素受体表达及提高颗粒细胞对卵泡刺激素的敏感性，成为发情周期中正常卵泡募集与优势卵泡选择发生的一种关键性调控因素[5]。在此过程中，睾酮作为底物，可被芳香化酶催化为雌二醇[6]，后者不仅通过刺激卵泡颗粒细胞与膜细胞的增殖分化，参与对正常卵泡发育的调控过程，而且优势卵泡合成大量雌二醇也是诱导排卵前促黄体生成素峰出现与排卵发生的必要前提[7]。临床研究发现，PCOS患者血清睾酮水平显著高于常人，且伴随着雌二醇水平的显著下降与排卵失败[8-9]。因此，从性激素在PCOS发生过程中的阶段性变化入手展开研究，可能是探明其发病机理的一个新思路。

构建小鼠疾病模型是研究PCOS发病机制的较佳方式[10]。在众多建模方式中，脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)最为常用，其作为合成雄激素的前体物质，通过向未性成熟雌鼠长期注射可模拟生成大量的囊性卵泡及造成较高的血清雄激素水平，进而产生PCOS样小鼠模型[11]。在建模过程中，DHEA常溶解在200 μL油性溶剂中，但对于长时间小鼠皮下注射而言，这种溶解方式可能会出现短时间内药物溶解不完全或因注射体积过大而易造成药物外渗与小鼠应激的情况。因此，本研究对现有DHEA建模方式稍作改进，将DHEA(6 mg/100 g)溶解在0.09 mL芝麻油与0.01 mL 95%乙醇混合的溶剂中，尝试构建3周龄昆明白小鼠的PCOS模型，并对该PCOS模型构建过程中的血清雌二醇和睾酮瞬时水平进行测定，以期从性激素相应变化角度来重新审视PCOS发病过程。

1 材料与方法

1.1 材料

使用90只3周龄SPF级昆明白小鼠进行建模，在12/12 h循环的光照条件下饲养，饲养过程遵循内蒙古农业大学生物医学科研伦理要求(批准编号：NND2021025)。

1.2 主要试剂及仪器

DHEA购自源叶生物公司；结晶紫粉末和多聚甲醛粉末均购自Sigma-Aldrich公司；睾酮ELISA试剂盒购自Cayman Chemical公司；雌二醇ELISA试剂盒购自Enzo公司；其他常用试剂均为国产或进口分析纯商品。

Nikon YS100成像系统购自Nikon公司；CM1900型石蜡切片机购自Leica公司；CYT-100多功能酶标仪购自GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 PCOS模型构建 90只昆明白小鼠被随机均分为3组：对照组、空载组(Vehicle)与DHEA组(DHEA)，对照组注射0.1 mL的生理盐水；空载组仅注射0.09 mL芝麻油与0.01 mL 95%乙醇的混合溶剂；处理组按体重计算所需注射的DHEA剂量，并将其溶解于等体积的芝麻油+95%乙醇混合的溶剂中。所有组别均连续皮下给药20 d。注射后使用75%酒精进行皮肤表面的消毒，随后放回到笼中，自由活动和采食。建模过程中的昆明白小鼠体重增量数据来自于建模第20与0天的差值(n=9)。

1.3.2 性周期鉴定 DHEA连续注射20 d后，于每天上午11:00-12:00使用20～50 μL生理盐水对昆明白小鼠的阴道进行冲洗并收集阴道上皮细胞，共持续8 d。将阴道上皮细胞涂抹在防脱载玻片上用95%乙醇固定10 min，使用0.1%结晶紫染色1 min。待玻片自然风干后，使用Nikon YS100成像系统进行扫描。根据阴道上皮细胞种类(是否角质化)、白细胞占比(主要为淋巴细胞)评估昆明白小鼠所处的性周期阶段[12]。

1.3.3 HE染色 使用4%多聚甲醛固定24 h后，自来水冲洗过夜。经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋与切片等处理，获取厚度为5 μm的组织切片。利用HE染色对卵巢组织学结构进行观察，并对昆明白小鼠卵巢是否产生PCOS样症状加以鉴定。

1.3.4 ELISA测定血清睾酮和雌二醇浓度 经眼球采血收集昆明白小鼠血液于非抗凝管中，室温放置2 h，4 ℃过夜。4 ℃、3 000 r/min多次离心分离血清，随后-80 ℃保存备用。

血清睾酮和雌二醇浓度的测定参照试剂盒说明书进行。使用多功能酶标仪分别在412和405 nm波长下检测睾酮和雌二醇样本D值。以标准物浓度为横坐标、吸光值为纵坐标建立标准曲线，分别代入待测样本D值以计算对应浓度。其中，睾酮数据来自DHEA处理的第5、10、15、20及21天(n=45)，而雌二醇数据来自DHEA处理的第5、10、15及20天(n=36)。

1.3.5 统计分析 试验数据使用GraphPad Prism 7.0进行分析，数据组之间的对比使用方差分析并配合Tukey检验共同进行。 结果以平均值±标准误表示，P<0.05被视为有统计学差异。

2 结 果

2.1 昆明白小鼠性周期鉴定

利用结晶紫染液对昆明白小鼠阴道黏液涂片进行染色，结果显示，在发情前期，阴道上皮细胞以有核和角质化上皮为主(图1A)；发情期阶段则只会出现角质化的上皮细胞(图1B)；发情后期则存在有核、无核上皮细胞及一定数目的淋巴细胞(图1C)；间情期则以大量的淋巴细胞为主，同时散在分布有核和无核上皮细胞(图1D)。

①A，发情前期；B，发情期；C，发情后期；D，间情期。②NEC，有核上皮细胞；CEC，角质化上皮细胞；L，淋巴细胞

2.2 注射DHEA对昆明白小鼠正常性周期的影响

对照组和空载组均在建模完成后的8 d内经历了2个完整的性周期循环(图2A、2B)，而DHEA组则长时间处于发情或发情后期，即产生了性周期停滞现象(图2C)。值得注意的是，虽然在昆明白小鼠处理的20 d内空载组体重增量显著高于对照组(P<0.05)，但与DHEA组相比并无显著变化(P>0.05，图3)。鉴于芝麻油注射后昆明白小鼠性周期依然正常运转，提示DHEA所引起的性周期变化与芝麻油引起的肥胖无关，说明注射DHEA使昆明白小鼠出现了PCOS样的性周期停滞现象，昆明白小鼠的生殖内分泌稳态发生了显著改变。

①A，对照组；B，空载组；C，DHEA组。②P，发情前期；E，发情期；M，发情后期；D，间情期

*，差异显著。图5～7同

2.3 DHEA对昆明白小鼠卵泡发育及血清睾酮水平的影响

HE染色结果显示，对照组和空载组卵巢中卵泡形态正常，且存在部分黄体细胞(图4A、4B)；DHEA组卵巢组织切片中出现了带有巨大空腔的囊状卵泡，且未见到黄体组织(图4C)。ELISA结果显示，随着建模的进行，0 d对照组与21 d对照组之间的血清睾酮水平无显著差异(P>0.05)；建模结束后，21 d对照组和21 d空载组昆明白小鼠体内血清睾酮水平无显著差异(P>0.05)；与对照组相比，DHEA组血清睾酮水平显著升高(P<0.05)(图5)。说明昆明白小鼠PCOS模型构建成功。

①A，对照组；B，空载组；C，DHEA组。②TCL，颗粒细胞层；GCL，颗粒细胞层；O，卵母细胞；L，黄体；CF，囊状卵泡

图5 昆明白小鼠血清睾酮水平测定

2.4 PCOS建模过程中血清睾酮和雌二醇浓度水平变化

睾酮水平测定结果显示，自DHEA处理的第5天起，DHEA组昆明白小鼠体内血清睾酮水平显著升高，且于第15天达到峰值，并持续至第20天(P<0.05，图6)。雌二醇水平检测结果显示，DHEA处理10 d后，血清雌二醇水平显著升高(P<0.05)，为同时期对照组的19.723倍；第15天时血清雌二醇水平仍显著高于对照组(P<0.05)；但在建模的第20天，DHEA组血清雌二醇水平开始下降并低于同时期对照组，但无显著差异(P>0.05)(图7)。

图6 PCOS模型构建过程中昆明白小鼠血清睾酮水平变化

图7 PCOS模型构建过程中昆明白小鼠血清雌二醇水平变化

3 讨 论

PCOS患者常伴随着高雄激素水平和较低的雌二醇水平，但目前对于PCOS发生过程中睾酮和雌二醇的变化却鲜有研究。本研究在对常规DHEA溶解方式进行改良的基础上，选择昆明白小鼠进行DHEA注射；随后对各试验组进行性周期鉴定、卵巢组织形态观察及血清睾酮水平测定，以判定PCOS模型构建是否成功，并在此基础上探讨了PCOS建模过程中的睾酮与雌二醇水平的变化规律。

对于小鼠而言，除非处于怀孕、假孕或性成熟前，其发情周期通常包括4个阶段：发情前期、发情期、发情后期和间情期，并以每4～5 d为一次循环[12]。现已证明，PCOS小鼠模型的特征之一为性周期的停滞与异常[13]。 本试验将常规200 μL芝麻油注射改为100 μL混合溶剂(90 μL芝麻油+10 μL 95%乙醇)，以便更好地溶解DHEA并减少试验动物的皮下注射应激。与对照组相比，DHEA注射能够成功使昆明白小鼠性周期停滞在发情或发情后期，且长期注射DHEA(20 d)没有影响到其体重指标。PCOS的另一个典型特征为卵巢的囊泡样变化[11]。通过20 d的DHEA处理，昆明白小鼠卵巢呈现出比对照组更大的囊泡样卵泡，提示其卵巢发生PCOS样改变。此外，研究者将DHEA刺激动物模型后产生的高水平睾酮作为判断PCOS模型构建成功的“金标准”[14-16]。本研究发现，DHEA处理组昆明白小鼠血清睾酮水平高达116.633 ng/mL，显著高于对照组(0.805 ng/mL)。综上，DHEA处理不仅造成了昆明白小鼠发情周期的停滞，而且卵巢卵泡也呈现出PCOS样典型特征，同时也伴随着血清睾酮浓度的显著升高。表明改良后的DHEA处理方式能够成功构建昆明白小鼠PCOS模型。

DHEA作为雄激素的前体物质，可体内转化为睾酮[17]。现已证明，PCOS患者体内的睾酮水平显著高于对照组的年轻女性[18]；同时长期暴露于高雄激素环境下的动物易形成PCOS样病变[19]。本研究发现，DHEA注射20 d后，未性成熟的昆明白小鼠血清睾酮浓度显著升高，这与Singh等[11]关于PCOS模型小鼠体内高水平睾酮的报道相一致。另外，连续注射5～20 d，昆明白小鼠体内睾酮持续处于较高水平，验证了异常升高的睾酮水平是诱导PCOS发生的一个核心因素的观点；同时建模成功后的血清睾酮浓度为对照组的200倍以上，可以为PCOS患者的临床鉴定提供参考。

在正常生理状态下，DHEA刺激所增加的睾酮会经由芳香化酶途径被转化为雌二醇，进而促使血清雌二醇水平升高[20]。此外，PCOS患者或动物模型的临床特征为卵巢发育活动停滞在大量囊泡状卵泡时期，该时期卵泡颗粒细胞较为活跃，但雌二醇水平较低[21]。本研究发现，DHEA组昆明白小鼠血清雌二醇水平在第10和15天显著高于对照组，且第10天出现了血清雌二醇浓度最大值，约为同时期对照组的19.723倍，推测雌二醇水平升高可能来自高浓度睾酮转化。值得注意的是，在高水平雄激素诱导的PCOS卵泡内，雌二醇水平远远低于同期卵泡的正常水平[22-23]。本研究也发现，DHEA注射10 d以后，昆明白小鼠血清雌二醇水平迅速降低，20 d后雌二醇水平降至正常水平以下，与上述报道相一致。研究证明，在PCOS模型小鼠中，高水平雄激素通过激活抗缪勒管激素转录，抑制芳香化酶P450活性，促使雌激素水平下降[24-26]。推测本研究发现的建模后期雌二醇水平降低的现象可能与睾酮向雌二醇转化途径受阻有关，但是建模过程中雌二醇瞬时升高是否具有其他病理意义，还需进一步探讨。

4 结 论

皮下注射混合溶剂溶解的6 mg/100 g DHEA可成功构建昆明白小鼠PCOS模型，该过程中睾酮水平在5 d后显著升高并持续至20 d，雌二醇水平整体呈现先升后降趋势，但雌二醇在建模中期瞬时升高的病理意义还需进一步研究。