绞股蓝多糖对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏抗氧化能力的影响

张润祥，白玉婷，张颖蕾，刘可可，王欣雨，董胤余，王晓丽

(广西大学动物科学技术学院，南宁 530005)

衰老是细胞甚至机体功能逐渐衰退的结果，可由氧化应激等多种因素触发[1]。研究证实，使用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导的小鼠会有自然衰老的症状，可加速活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生并导致氧化应激[2-3]。超量的ROS会损伤DNA、蛋白质和磷脂的结构，最终导致细胞损伤，进而引起生理功能受损、发病率增加和寿命缩短，这种由ROS引起的氧化损伤和不可逆的累积是影响衰老过程的关键因素[4-5]。肝脏是机体最主要的解毒器官，是多个生理过程的关键枢纽，也是产生超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等多种抗氧化酶的场所，因此肝脏是特别容易受到氧化应激影响的器官之一[6-7]。

近年来，随着中草药多糖研究的开展，关于多糖抗衰老的探究也逐步深入。 绞股蓝多糖(Gynostemmapentaphyllumpolysaccharides，GPP)是绞股蓝的有效成分之一，具有免疫调节、降血脂及抗肿瘤等多种药理活性[8-10]。目前，国内外鲜见有关GPP对D-gal致衰小鼠，尤其是对D-gal 致衰小鼠肝脏保护影响的报道。为此，本研究以D-gal建立衰老模型，采用多种方法探究不同剂量GPP对D-gal致衰老小鼠肝脏的抗氧化能力，以期为绞股蓝及GPP的进一步研究与开发利用提供新的方向与理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组与样品采集

60只4周龄SPF级昆明小鼠(许可证编号：SYXK桂2014-0001)，体重(20±1)g，购自广西医科大学动物实验中心，实验动物房标准鼠笼中饲养，每笼5只。小鼠随机分为6组(雌雄各半)：空白对照组(Control)、模型组(D-gal)、阳性对照组(Vc)及绞股蓝多糖低、中、高剂量组(GPP-L、GPP-M和GPP-H)，每组10只。空白对照组每天在颈背部皮下注射和腹腔注射生理盐水；其余5组除每天颈背部皮下注射200 mg/kgD-gal外，腹腔注射依次为生理盐水、Vc(200 mg/kg)、GPP(50、100和200 mg/kg)，42 d后称重记录，禁食，次日眼眶取血，处死后收集肝脏，部分组织置于Bouin氏固定液用于切片制作，其余组织液氮冻存，之后-80 ℃保存备用。

1.2 GPP提取与糖含量测定

绞股蓝购自广西中医药大学第一附属医院。经洗净、烘干、粉碎后3 cm过筛加工，避光干燥保存。采用水提醇沉法提取GPP，苯酚硫酸法测定GPP含量为71.1%。

1.3 体重与脏器系数测定

试验开始后，分别在1、7、14、21、28、35和42 d称重并记录。小鼠处死后，摘取肝脏生理盐水清洗，滤纸吸干表面水分后称重，计算脏器系数。

脏器系数(%)=脏器重量(mg)/体重(g)×100%

1.4 血清总抗氧化能力检测

各组小鼠眼眶取血后，置于EP管4 ℃静置2 h，待血液凝固后，冷冻离心机3 500 r/min离心15 min，取上清液分装,于-80 ℃保存。 参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书，采用酶标仪(Bio-Rad公司)检测血清总抗氧化能力(T-AOC)水平。

1.5 肝组织各指标检测

冻存肝脏组织解冻后，取部分样品按1∶9(W/V)的比例预加冷生理盐水，组织匀浆后离心取上清液，参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书检测SOD、GSH-Px、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量；取部分样品加入适量PBS，匀浆后3 000 r/min离心20 min，取上清液按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书检测ROS含量。

1.6 石蜡切片与HE染色

肝脏组织固定后，修整、冲洗，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片厚7 μm，于37～40 ℃水浴锅内捞片，38 ℃烘箱内拷片。常规HE染色，中性树脂封片，显微镜观察并拍照。

1.7 统计学分析

数据采用SPSS 21.0软件处理，图片应用Image J软件分析；组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 GPP对D-gal致衰老小鼠体重的影响

用药开始后，每周称量小鼠体重并记录，经计算得出小鼠体重和增重的变化情况，结果见表1、2。由表1可知，随日龄增长各组小鼠体重均呈现增长趋势，7、21、28和35 d时GPP-M组小鼠体重显著低于D-gal和GPP-H组(P<0.05)；42 d时GPP-M组小鼠体重显著低于GPP-H组(P<0.05)，但与其他试验组间差异均不显著(P>0.05)。

表1 各组小鼠体重(n=10)

由表2可知，空白对照、D-gal、Vc、GPP-M和GPP-H组小鼠增重在29～35 d时达到最低，随后出现增长的趋势，而GPP-L组在22～28 d时先降低，经过29～35 d小幅度上升后再次出现下降趋势；1～7 d时，GPP-M组小鼠增重显著低于D-gal组(P<0.05)；15～21 d时，GPP-M组小鼠增重低于D-gal组，显著低于GPP-H组(P<0.05)；29～35 d时，GPP-M组增重显著低于GPP-L组(P<0.05)。 综合来看，1～42 d GPP-M组小鼠增重最少。

表2 各组小鼠增重的变化(n=10)

2.2 GPP对D-gal致衰老小鼠肝脏指数及血清T-AOC的影响

由表3可知，GPP各剂量组肝脏指数均高于D-gal组，其中GPP-H组小鼠肝脏指数显著高于D-gal 组(P<0.05)，与Vc和空白对照组相比均无显著性差异(P>0.05)；不同剂量GPP组血清T-AOC活性与D-gal组相比均有所增强，且小鼠血清T-AOC活性随GPP浓度的升高而增强，其中GPP-H组小鼠血清T-AOC活性最高，与D-gal组相比差异显著(P<0.05)。

表3 衰老小鼠肝脏指数及血清中T-AOC水平

2.3 GPP对D-gal致衰老小鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT活性和ROS、MDA含量的影响

由表4可知，GPP各剂量组的小鼠肝脏组织SOD活性与D-gal组相比均无显著差异(P>0.05)；不同剂量GPP处理后的小鼠肝脏中GSH-Px、CAT活性与D-gal组相比均有所增强，其中GPP-M组小鼠肝脏中GSH-Px活性显著高于D-gal组(P<0.05)，GPP-L组小鼠肝脏中CAT活性显著高于D-gal 组(P<0.05)，与Vc和空白对照组相比均无显著差异(P>0.05)，3个剂量组间均无显著差异(P>0.05)；不同剂量GPP处理后的小鼠肝脏组织中ROS、MDA含量与D-gal组相比均显著下降(P<0.05)，其中GPP-L组小鼠肝脏组织中的ROS含量显著低于GPP-M和GPP-H组(P<0.05)，且与Vc和空白对照组相比均有显著差异(P<0.05)，GPP-L和GPP-H组肝脏中MDA含量与GPP-M组相比下降明显，但3个GPP剂量组间差异均不显著(P>0.05)。

表4 衰老小鼠肝脏中SOD、GSH-Px、CAT活性及ROS、MDA含量

2.4 GPP对D-gal致衰老小鼠肝脏组织形态结构的影响

各组小鼠肝脏经HE染色后，观察肝脏组织形态，结果显示，空白对照组小鼠肝细胞结构正常(图1A)，中央静脉无任何异常，肝索有规律的整齐排列，肝血窦无扩张；D-gal组小鼠肝细胞变大(图1B)，胞浆嗜酸性增强，胞核增大，染色增强，且出现明显的双核肝细胞，肝细胞之间连接松散，部分肝细胞胞浆内可见小的脂肪颗粒，肝血窦扩张明显；而经过Vc处理的小鼠肝细胞索排列整齐紧密(图1C)，少量肝细胞可见双核，与D-gal组相比出现脂肪颗粒的肝细胞减少；GPP-L组肝血窦扩张明显(图1D)，双核肝细胞较多，肝细胞连接松散；GPP-M组肝血窦缩小(图1E)，肝细胞索排列较整齐紧密，部分肝细胞可见双核；GPP-H组与D-gal组相比肝血窦缩小(图1F)，肝细胞连接紧密，存在脂肪颗粒的肝细胞明显减少。

①A，空白对照组；B，D-gal组；C，Vc组；D，GPP-L组；E，GPP-M组；F，GPP-H组。②HC，肝细胞；BH，双核肝细胞；HS，肝血窦；FP，脂肪颗粒；CV，中央静脉

随机选取每组小鼠肝脏切片3张，每张随机选择3个视野，运用Image J软件进行分析，结果见表5。由表5可知，经GPP-H处理的小鼠肝脏肝索面积占比与D-gal组相比有所增加，与空白对照和Vc组相比占比相当，差异不显著(P>0.05)；GPP-M和GPP-H组小鼠肝脏肝索面积占比显著高于GPP-L组(P<0.05)。

表5 小鼠肝脏组织切片中肝索面积占比

3 讨 论

3.1 D-gal衰老模型的建立

动物衰老模型是研究衰老及其机理以及抗衰老相关药物等的前提和基础。现代医学研究中，有D-gal衰老模型、β-淀粉样蛋白衰老模型、氯化铝衰老模型、臭氧损伤衰老模型、γ-射线辐射衰老模型、胸腺摘除致衰老模型及各种转基因衰老模型[11]。其中D-gal诱导的衰老以其操作简单、成本低廉、周期短等优点被广泛应用于制备衰老模型。D-gal是一种天然存在于人体内的正常营养素，当细胞内D-gal浓度过高，无法被半乳糖氧化酶催化生成醛糖和过氧化氢时会产生超氧阴离子，氧化产生大量自由基，超出机体清除能力，从而导致脂质过氧化；同时，最终分解产物可直接或间接与蛋白质、核酸、磷脂等物质结合，破坏细胞结构和功能，进而导致重要器官代谢紊乱，最终导致机体衰老[12-14]。张鑫等[15]用D-gal诱导小鼠原代皮肤成纤维细胞成功建立了衰老模型；张常娥等[16]用D-gal皮下注射8周，复制出与24月龄老年大鼠自然衰老程度相似的亚急性衰老模型。因此，本研究选择D-gal致衰老模型来研究GPP对致衰老小鼠肝脏的保护作用。

3.2 GPP对D-gal致衰老小鼠体重、肝脏指数和组织形态结构的影响

小鼠的体重增长是反映各组小鼠生长发育情况的一个重要指标，而脏器指数的变化又可以体现出细胞衰老程度。葛水莲等[17]、陈兴浩等[18]研究发现，衰老模型组小鼠脏器指数显著下降。本研究发现，D-gal组小鼠肝脏指数低于其他各组，且显著低于GPP-H组，表明GPP改善了肝脏的衰老程度；各组小鼠体重均呈增长趋势，D-gal组小鼠1～14 d增重高于其他各组，推测可能是由于致衰早期代谢物质在体内累积造成的，15～42 d增重低于GPP组，可能是由于GPP保护了致衰导致的脏器功能，促进了机体代谢和物质吸收。

肝细胞是肝脏的实质细胞，不仅可以调节碳水化合物、脂肪酸的代谢以及合成白蛋白、脂蛋白和胆固醇等物质，还可以促进药物和外源性物质代谢等[19]。此外，肝细胞还可以释放血管内皮生长因子，以此来控制肝脏的生长和修复[20]。随着年龄的增长，肝细胞基因组逐渐出现不稳定，肝细胞数量减少，多核肝细胞数量增加，脂质过氧化产物积累和核DNA损伤[21]，衰老相关的信号通路如p16、p21和p53失调[22]。本研究从形态学角度发现，GPP可以改善由D-gal致衰导致的肝血窦变宽、双核细胞增多、肝索面积减少、肝细胞内脂肪颗粒增多等，表明GPP可以恢复致衰小鼠的肝脏组织结构，保证其功能的完整性。

3.3 GPP对D-gal致衰老小鼠血清T-AOC的影响

正常情况下，氧自由基和抗氧化防御系统在机体内是动态平衡的。当异常情况发生时，由于机体防御自由基的系统失衡，致使各种酶活性降低、免疫功能下降等，从而导致机体的衰老和死亡。T-AOC可以反映出机体内抗氧化防御系统对自由基的总体抵抗能力。陈玉兴等[23]、陈英等[24]研究发现，益智汤、石榴汁、小麦胚活性肽均可以提高衰老小鼠血清中T-AOC活性；赵莲芳等[25]指出，黄芪多糖可以提高衰老小鼠血清和肝脏中T-AOC活性。本研究发现，GPP各剂量组也能使衰老小鼠血清T-AOC水平上升，表明GPP可以提高衰老小鼠对自由基过氧化的总体抵抗能力。

3.4 GPP对D-gal致衰老小鼠肝脏SOD、GSH-Px、CAT、ROS和MDA的影响

SOD可以清除机体内产生的氧自由基，从而能够使细胞生物膜免受损伤，起到抗氧化作用。陈兴浩等[18]研究发现，D-gal致衰老小鼠体内SOD活性大大降低，而牛乳清粉可以提高D-gal致衰小鼠SOD活性；汪群红等[26]研究发现，西红花可以很好地提升衰老大鼠SOD活性。本研究发现，GPP-M组能够提升衰老小鼠肝组织中SOD活性，提示GPP能够保护机体细胞膜，从而提高了衰老小鼠的抗氧化能力。

GSH-Px能够将过氧化物和还原性谷胱甘肽催化还原，保护细胞生物膜结构和功能上的完整，从而达到增强机体抗氧化能力的目的。武铮等[27]研究发现，D-gal致衰老小鼠脑内的GSH-Px活性大大下降，而当归多糖可以明显提高脑内GSH-Px活性；冯沼润[28]研究发现，天葵子可以改善D-gal致衰老小鼠血清和肝脏的GSH-Px活性。本研究发现，GPP可以很好地提高衰老小鼠肝脏的GSH-Px活性，表明GPP能够保护和维持机体生物膜结构和功能的完整性，从而提高了衰老小鼠肝脏的抗氧化能力。

CAT的主要功能就是清除H2O2，抑制活性极强的羟自由基的生成，从而达到保护机体不受到羟自由基氧化损伤的作用。Lu等[3]研究发现，衰老小鼠CAT活性明显降低，而乌索酸可以提高D-gal致衰老小鼠的CAT活性，起到神经保护作用；颜燕等[29]研究指出，绞股蓝、山楂提取物可以提高D-gal致衰老小鼠肝脏的CAT活性。本研究发现，GPP也可以提高衰老小鼠肝脏的CAT活性，说明GPP可以增强衰老小鼠肝脏清除H2O2的能力，从而提高了衰老小鼠肝脏的抗氧化能力。

ROS是伴随体内氧化过程产生的，如果超出了机体的清除能力，将会导致脂质过氧化；同时，这些最终分解产物可直接或间接与蛋白质、核酸、磷脂和其他物质结合，破坏细胞内生命物质的化学结构及细胞功能，从而导致重要器官代谢的紊乱，使得机体衰老[30]。唐汉庆等[31]研究发现，铁皮石斛可以很好地降低小鼠体内ROS含量，提高其抗氧化能力；张秀丽[32]研究发现，梓醇可以降低脑中ROS含量，很好地保护衰老小鼠的神经细胞。本研究发现，GPP各剂量组均可以降低致衰老小鼠肝脏中ROS含量，表明GPP可以通过降低ROS含量提高其抗氧化能力，延缓衰老。

MDA是体内脂质过氧化产物，而机体内脂质过氧化水平便是由MDA含量的多少决定的[18]。MDA与蛋白质、核酸等交联物具有异常的氢键，经溶酶体吞噬后不会被溶解消化，反而储存在细胞内成为脂褐素，而脂褐素的大量堆积会导致细胞代谢紊乱，从而造成细胞的死亡。同时MDA作为细胞膜上不饱和脂肪酸过氧化反应的终末产物，可以反映机体内的氧化程度。葛水莲[17]指出，经太行菊黄酮处理的D-gal致衰老小鼠肝脏、脑等组织中MDA含量均有所下降；汪群红等[26]发现，西红花可以明显降低脑、肝脏、肾脏匀浆中MDA含量，延缓衰老。本研究发现，GPP各剂量组均可以降低衰老小鼠肝脏中MDA含量，表明GPP可以减少体内脂质的过氧化反应。

4 结 论

GPP可以有效提高D-gal致衰老小鼠肝脏抗氧化能力，延缓衰老，其中100 mg/kg GPP对D-gal致衰小鼠肝脏抗氧化效果最明显。