甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激的影响

杨 裕，关文超，崔小珍，贾永鑫，YANG Shiyu

(1.山西农业大学动物医学学院，太原 030801；2.伦敦大学学院外科和介入科学系，伦敦 WC1E 6BT)

副猪嗜血杆菌是健康猪呼吸道中的常在菌[1]。在一定条件下，副猪嗜血杆菌可导致猪群出现多发性浆膜炎综合征[2]。到目前为止，已确定副猪嗜血杆菌有15种血清型，但超过20%的临床分离株还无法确定血清型。虽然已从副猪嗜血杆菌筛选到许多毒力因子[3]，但副猪嗜血杆菌致病的确切机制尚未得到详细阐明。喹诺酮、β-内酰胺、大环内酯和四环素等抗菌药治疗仍然是副猪嗜血杆菌病防控的首要选择[4]，但易增加耐药株并产生多重耐药风险，导致可供选择的治疗方案越来越少[5]。当前疫苗存在保护效果低或交叉保护差等缺陷，接种疫苗并不能有效控制副猪嗜血杆菌感染[6]，使得控制猪群副猪嗜血杆菌病变得非常困难[7]。副猪嗜血杆菌病给全世界养猪业带来的经济负担仍然是一个严重的问题[8]。因此，研发抗副猪嗜血杆菌的新型药物已成为当务之急。

从植物中分离出的酚类、糖类等物质在体外具有抗菌活性[9]。甘草是多年生植物的根和根状茎，广泛应用于微生物感染、癌症等疾病的治疗[10]。甘草的主要成分包括甘草酸、三萜类、多酚类、黄酮类、葡萄糖、氨和蔗糖。甘草查尔酮A是甘草中主要的黄酮类化合物，因其具有抗寄生虫、抗菌和抗炎等多种药理作用近年来引起了人们的广泛关注[11]。以往的研究证实，甘草查尔酮A可提高小鼠抵抗副猪嗜血杆菌感染的能力[12]。副猪嗜血杆菌感染可引起猪肺泡上皮细胞发生氧化损伤[13]，甘草查尔酮A可有效抑制乙酰氨基酚氧化损伤小鼠丙二醛(MDA)的形成，并降低肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性[14]，说明甘草查尔酮A具有抗氧化作用。因此，本研究拟选取猪肺泡巨噬细胞进行体外研究，探讨甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞氧化应激的调节作用，为甘草查尔酮A作为治疗副猪嗜血杆菌感染的新型药物在副猪嗜血杆菌感染的临床应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 6周龄健康断奶雌性仔猪来源于一个过去10年里副猪嗜血杆菌均阴性的养殖场，体重(12.0±1.0) kg，副猪嗜血杆菌检测为阴性。

1.1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清(FBS)和DMEM培养基均购自HyClone公司；CCK-8试剂盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；MDA、一氧化氮(nitric oxide，NO)、GSH-Px、SOD和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；甘草查尔酮A购自北京酷来搏科技有限公司。

副猪嗜血杆菌培养液：TSA(tryptic soy agar，TSA)或TSB(tryptic soy broth，TSB)培养基+10 mg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)+5% FBS。

甘草查尔酮A配制：将甘草查尔酮A溶解于二甲基亚砜(DMSO)配制成20 mg/mL浓储液，-20 ℃保存备用，临用时用高糖DMEM进行稀释。

超净工作台(SW-CJ-1F)购自苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养箱(HH-B11)购自上海飞越实验仪器有限公司；CO2培养箱(HERAcell VIOS 160i)购自Thermo Fisher Scientific公司；可见光分光光度计(UV-5100)购自上海精密仪器仪表有限公司；酶标仪(SpectraMax M5)购自TECAN公司；荧光显微镜(BX53)购自Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 猪肺泡巨噬细胞的分离与培养 按Shabir等[15]的方法经肺泡灌洗分离猪肺泡巨噬细胞。即通过静脉注射戊巴比妥对猪进行安乐死，解剖打开胸腔，连同气管剥离完整肺脏，用100 mL含有70 μg/mL庆大霉素的无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)灌洗支气管肺泡。500 r/min离心10 min后收集细胞，用含50 μg/mL庆大霉素的高糖DMEM冲洗3次。计数后，细胞在含10%(V/V)热灭活FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基中37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 细胞分组与处理 将猪肺泡巨噬细胞按1×105/孔接种到96孔细胞培养板中，用副猪嗜血杆菌(MOI=10)感染猪肺泡巨噬细胞后，分为6组：阴性对照组(NC)，未感染副猪嗜血杆菌的猪肺泡巨噬细胞；阳性对照组(PC)，猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后不用药物处理；DMSO组，猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后给予0.1% DMSO；5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组，猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后给予相应浓度的甘草查尔酮A。 各组细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，收集细胞或上清液进行后期检测。 每组均设置3个重复。

1.2.3 细胞活力检测 根据Zheng等[16]的报道采用CCK-8法检测细胞活力。将CCK-8溶液(10 μL)加入到各处理组96孔细胞培养板中，37 ℃继续孵育2 h后,根据CCK-8检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪检测D450 nm值，按如下公式计算各组细胞活力。

细胞活力(%)=(D450 nm试验组-D450 nm空白组)/(D450 nm对照组-D450 nm空白组)×100%

1.2.4 LDH活性检测 为分析副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的细胞溶解情况，将各处理组细胞培养板1 000 r/min离心5 min，收集上清液。根据LDH检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪检测D490 nm值表示各组细胞外LDH活性。

1.2.5 氧化/抗氧化指标检测 按Ceker等[17]报道的方法检测猪肺泡巨噬细胞氧化/抗氧化平衡状况。收集各处理组猪肺泡巨噬细胞，用PBS洗2次。细胞在频率为100 Hz下超声处理2个循环，然后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清。按照MDA、NO、GSH-Px、SOD和T-AOC试剂盒说明书进行操作，根据标准曲线计算各组猪肺泡巨噬细胞MDA、NO水平及GSH-Px、SOD和T-AOC活性。

1.2.6 ROS水平检测 根据Liu等[18]的方法检测细胞内ROS生成情况。细胞用PBS洗2次，在培养液中加入终浓度为5 μmol/L的2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯，37 ℃、5% CO2孵育60 min，用荧光显微镜观察细胞内的绿色荧光并拍照，用Image J 1.48软件分析荧光强度变化。

1.3 统计分析

用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间用t检验进行比较，结果用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞活力的影响

由图1可知，DMSO组与PC组无明显变化，说明DMSO对猪肺泡巨噬细胞无毒性作用。副猪嗜血杆菌感染24 h后，与NC组相比，PC组及5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞的活力均显著降低(P<0.05)。与PC组相比，5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞活力均显著提高(P<0.05)，细胞活力随着甘草查尔酮A浓度的增加而增加。

与NC组相比，#，差异显著(P<0.05)；与PC组相比，*，差异显著(P<0.05)。下同

2.2 甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞LDH活性的影响

由图2可知，副猪嗜血杆菌感染24 h后，与NC组相比，PC组及5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞上清液LDH活性均显著提高(P<0.05)。与PC组相比，5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞上清液LDH活性均显著降低(P<0.05)，LDH活性随着甘草查尔酮A浓度的增加而降低。

图2 各组猪肺泡巨噬细胞LDH活性

2.3 甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞氧化/抗氧化指标的影响

由表1可知，副猪嗜血杆菌感染24 h后，与NC组相比，PC组猪肺泡巨噬细胞的MDA和NO水平及SOD活性均显著增加(P<0.05)，而2组之间GSH-Px和T-AOC的活性差异不显著(P>0.05)；5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组MDA和NO水平及GSH-Px、SOD和T-AOC活性均显著增加(P<0.05)。与PC组相比，5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞的MDA和NO水平呈剂量依赖降低，其中10和20 μg/mL甘草查尔酮A组显著降低(P<0.05)；5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组GSH-Px、SOD和T-AOC活性均呈剂量依赖性显著升高(P<0.05)。

2.4 甘草查尔酮A对副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞ROS产生的影响

由图3可知，与NC组相比，副猪嗜血杆菌感染24 h后，PC组及5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞均出现较强的绿色荧光信号。与PC组相比，5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组细胞的绿色荧光信号有所降低(图3D～3F)，其中，在20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞绿色荧光信号非常弱。定量分析结果也显示，与NC组相比，PC组及5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞的ROS水平均显著增加(P<0.05)；与PC组相比，5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组猪肺泡巨噬细胞的ROS水平均显著降低(P<0.05)(图4)。

A～F，分别代表NC组、DMSO组、PC组及5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A组

图4 各组猪肺泡巨噬细胞ROS的定量分析

3 讨 论

肺部感染副猪嗜血杆菌时，肺泡巨噬细胞在抵抗细菌致病方面发挥着重要的作用[19]。Olvera等[20]建立了副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的体外模型，为研究副猪嗜血杆菌与宿主免疫细胞的互作提供了重要帮助。本研究结果发现，猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后活力显著降低，与副猪嗜血杆菌感染猪肺泡上皮细胞导致活性降低的研究结果一致[13]。而甘草查尔酮A处理后，猪肺泡巨噬细胞活力得到明显提高。

LDH活性被认为是氧化应激条件下检测细胞状态的可靠标记[21]。本研究发现，猪肺泡巨噬细胞感染副猪嗜血杆菌后LDH释放量显著增加，而张学谅[22]发现副猪嗜血杆菌辽宁分离株感染PK-15细胞后细胞LDH相对释放量极显著增加。在H2O2诱导心肌细胞损伤模型中，甘草查尔酮A可抑制LDH的活性[23]。在本研究中，甘草查尔酮A亦可抑制副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞LDH的释放，这说明甘草查尔酮A可缓解副猪嗜血杆菌对巨噬细胞的损伤。

氧化应激标志物MDA是氧化应激代谢过程中评估脂质过氧化状态的重要指标。以往研究发现，副猪嗜血杆菌感染猪肺泡上皮细胞后猪肺泡上皮细胞MDA和NO氧化水平明显增高，而GSH-Px、SOD和T-AOC活性显著降低，猪肺泡上皮细胞出现氧化-抗氧化平衡紊乱[13]。本研究结果表明，与未感染的猪肺泡巨噬细胞相比，副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的MDA和NO水平明显增加，说明副猪嗜血杆菌感染可引发非免疫细胞和免疫细胞氧化-抗氧化平衡紊乱。细胞中的内源酶和非酶抗氧化剂在防御各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的氧化损伤中发挥着重要作用[24]。在乙酰氨基酚氧化损伤的小鼠模型中，甘草查尔酮A可有效抑制MDA的形成，并降低肝脏中GSH和SOD的活性[14]。本研究发现，甘草查尔酮A处理后，猪肺泡巨噬细胞中的GSH-Px、SOD和T-AOC活性均显著提高，同时MDA和NO的水平降低，即甘草查尔酮A在细菌诱发猪肺泡巨噬细胞的氧化-抗氧化平衡紊乱中趋向于提高抗氧化作用。

氧化造成炎症是疾病发生的重要因素之一。机体免疫细胞或非免疫细胞在受到致病性微生物感染后产生过量ROS，常常引发氧化应激[25]，并可能导致持久性细菌感染[26]。本研究发现，副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞后细胞内ROS活性明显升高。副猪嗜血杆菌还可刺激外周血单核细胞产生ROS，导致组织氧化损伤，而预先给予黄芩苷干预，细胞ROS活性明显降低[27]，2～8 μg/mL甘草查尔酮A可以抑制肝细胞的氧化作用[28]。此外，甘草查尔酮A可显著降低脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性氧化性肺损伤[29]。本研究发现，5～20 μg/mL甘草查尔酮A处理猪肺泡巨噬细胞时，副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞ROS活性显著降低，进一步说明甘草查尔酮A可保护细胞免受氧化损伤。

4 结 论

副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞后其活力降低，LDH活性及ROS、MDA和NO水平增加，5、10和20 μg/mL甘草查尔酮A均显著提高副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的活力及GSH-Px、SOD和T-AOC活性，降低LDH和ROS活性以及MDA和NO水平。研究结果可为将甘草查尔酮A应用于抗副猪嗜血杆菌感染制剂的研发奠定基础。